Summary
본는 lipidic mesophases 수동으로 막 단백질의 결정화 실험을 설정 캐퍼리 막 구조 및 기능 생물학 그룹의 구현 절차를 설명합니다.
Abstract
lipidic mesophases를 사용하여 막 단백질을 crystallizing에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법은 여러가지 lipidic 입방 단계 또는 meso 방법에 규정된되었습니다. 메소드가 prokaryotic와 진핵세포 단백질의 X - 레이 crystallographic 구조, monomeric, 호모 및 이종 multimeric, 발색단 함유하고 발색단 - 무료 단백질을 해결하는 데 사용되었다는에서 매우 다재 다능한 것으로 표시하고, 알파되었습니다 - 나선형 및 베타 배럴 단백질. meso의 결정에 사용하는 최근의 성공은 인간 공학 beta2 - 아드레날린과 아데노신 A2a G 단백질 결합 수용체 있습니다. 프로토콜은 monoolein 기반 mesophase에 막 단백질을 reconstituting, 그리고 매뉴얼 모드에서 crystallizations을 설정 제공됩니다. 이러한 결정 수확 등 전반적인 과정에서 추가적인 단계, 미래의 비디오 기사에 해결 될 수 있습니다. 시간이 단백질 로드된의 mesophase를 준비하고 결정 플레이트를 설정하는 데 필요한 수동으로 약 1 시간입니다.
Protocol
구조 및 기능 생물학 분야에서 중요한 초점은 생물 학적 막 (그림 1)입니다. 셀을 클릭하고 하위 세포 organelles 현재 주변 막이, 두 개만 지질 분자를 통해 molecularly 얇은 구조이며, 단백질과 함께 박혀있다. 로 지질과 단백질을 모두 적용 구조와 기능은 관심이 있습니다. 그러나,이 문서의 초점은 막 단백질로 제한됩니다.
막 단백질은 분자 수준에서 작동하는 방법의 더 나은 이해는 두 가지 이유에 대해 모색하고 있습니다. 첫째, 그들이 일하는 방법을 아는의 지적 만족이 있습니다. 둘째, 단백질이 어떻게 작동하는지 아는가, 그것이 특정 응용 프로그램을 위해 수정도 고장 그것해야하거나 개선이나 고칠 수있는 전망은 항상있다. 약물 설계 작품의 이러한 종류의 명백한 결과입니다. 막 단백질은 분자 수준에서 어떻게 작동하는지 냈지 한 접근 방식의 구조를 결정하는 것입니다. 이것은 단백질을 구성하는 모든 원자의 3 차원 공간에서 위치, 또는 적어도 아닌 모든 수소 원자를 확립 포함됩니다. 우리가이 목적을 위해 사용하는 방법은 macromolecular X - 선 crystallography (MX)입니다. 그림 2는 구조 MX를 사용하여 결정되었다 막 단백질의 예를 보여줍니다. 단백질의 회절 품질 결정이 MX를해야합니다.
분명, macromolecular의 crystallography를 사용하여 구조 결정에 관련된 많은 단계가 있습니다. 이것은 그림 3에서 그림입니다. 일반적으로, 이들은 막 단백질 대상을 식별하는 포함하고, 생산 정화하고 crystallizing. 회절 측정은 가정이나 싱크로 트론 X - 선 소스를 사용하여 결정에 수행됩니다. 회절 데이터는 분자 모델을 장착하는 전자 밀도지도를 항복 처리됩니다. 모델은 세련된 때, 단백질의 행동의 메커니즘을 탐구하는 데 사용과 구조 기반 약물 설계. 수 있습니다
이 문서의 초점은 우리가 meso 방식의 이른바하여 lipidic mesophases를 사용하여 막 단백질의 회절 품질 결정 생산 방법을 보여줍니다. 방법과 범위의 최근 검토 참조 1 (여보세요, 2009)에서 사용할 수 있습니다. 우리가 따를 단계별 프로토콜 참조 2 (팀장과 Cherezov 2009)에 설명되어 있습니다.
meso 막 단백질 결정화 재판에서 설정에 필요한 시간과 관련된 단계를 요약 흐름도는 그림 4에 표시됩니다. 이 문서는 점선 붉은 선으로 둘러싸인 그 단계를 다루고 있습니다.
1 부 : 결정화 접시를 준비
- 작업 벤치에서 silanized 현미경 슬라이드를 놓습니다.
- 다공 더블 스틱 스페이서 테이프의 스트립 (상용, 특정 시약 및 장비 아래 표 참조) 중 하나 표면에서 보호 종이 커버를 제거합니다.
- 슬라이드의 표면과 접촉, 아래 테이프, 스티커 옆에 놓습니다.
- 압력 인감 브레 이어 또는 롤러를 사용하여 슬라이드에 테이프를. 알루미늄 호일은 테이프와 우물의 기지를 보호하기 위해 롤러 사이에 삽입할 수 있습니다.
- 그 상위 끈적끈적한 표면을 노출하는 테이프에서 두 번째 종이 커버를 제거합니다.
- 빨리 로딩으로 우물의 신속하고 효율적인 씰링을위한 플레이트와 근접 거리에 플레이스 개별 silanized coverslips이 완료되었습니다.
2 부 : 준비 지질 주사기
- 3 분 ° C 그것이 용융 렌더링 45에서 온도 제어 블록에있는 지질 (자주 monoolein)를 놓으십시오.
- 지방질이 녹아있는 동안 지질 단백질 혼합 단계에서 사용하는 두 100 μL 가스 기밀 해밀턴 주사기를 준비합니다. 단백질 솔루션을 포함합니다 주사기에서 테플론 물미를 제거합니다. (장소에의 물미를 떠나) 그 옆에있는 지질을 개최합니다 주사기를 놓습니다.
- 지질 주사기로 (특정 시약 및 장비 아래와 레퍼런스 3 (쳉 외 표를 참조하십시오., 1998)) 커플러를 연결합니다. 주사기에 커플러를 손가락 - 조여하지만 오버 조여하지 않습니다. 지질 주사기의 총신에서 플런저를 제거합니다.
- 지방질이 계속 진행하기 전에 용융 있어야합니다. 30 μL에 피펫을 설정 천천히 녹은 지방질의 약 30 μL를 가져가라. 천천히 당신이 수있는 공기 격차를 소개하지 돌보는 주사기의 열린 끝에 녹은 지방질의 많은를 제공합니다.
- 녹은 지방질과 접촉 배럴로 플런저를 놓고 천천히 수직으로 비디오에서 보여준 개최 주사기와 총신 최대 플런저를 전진. 실수로 갇혀있을 수 있습니다 공기 방울이 과정에서 상승해야하고 발표합니다.
- 조심스럽게 주사기 배럴에 표시를 읽는하여 주사기 안에 지방질의 볼륨을 결정합니다.
- 해주실 슬라이드커플러에서 연장 바늘에 ule. 총신 일어나서 천천히 그리고 부드럽게 커플러의 핵심에있는 바늘에 녹은 지방질을 강제로 플런저를 사용합니다.
파트 3 : 준비 단백질 주사기
- 단백질 솔루션은 4 5~10분에 대한 1만4천g에 소용되어야 ° C는 결정화 실험을 설정하기 전에 큰 집계를 제거하십시오. 얼음에서 단백질 용액을 제거하고 실온에서 평형 수 있습니다.
- 에서 입방 단계를 폼 또는 전체 수화 가까이하는 데 사용할 단백질 솔루션의 볼륨을 계산합니다. monoolein 들어 20 ° C, 물을 가득 수화는 위상 그림 5 (그림 5)에 가까운 40 %의 물 (질량에 의해)에 발생합니다.
- 25 또는 50 μL 해밀턴 주사기와 함께 단백질 솔루션의 필요한 볼륨을 차지. 공기 방울을 피하기 위해 돌보는 단백질 주사기의 총신에있는 플런저의 테플론 팁에 솔루션을 전송합니다.
- 조심스럽게 바늘을 철회하고 주사기에 단백질 용액의 볼륨을 측정합니다. 그것은 이전 단계에서 전달되는 값과 일치해야합니다.
- 천천히 오픈 엔드와 플러시를 종료하기 위해 총신 최대 단백질 솔루션을 인치.
- 지질 주사기에 연결된 커플러의 오픈 엔드에 단백질 주사기 보자. 이것은 장치가 과도하게 강화되지 않을 것이 중요합니다. 이상 - 강화 단계에서 조립 혼합 장치하면 ferrules에 손상을 누출하게됩니다. 아래 - 강화는 또한 누수로 이어질 것입니다.
4 부 : 혼합 단백질 솔루션 및 지질 : Mesophase 만들기
- 혼합 효과, 커플러 통해 지질 주사기로, 단백질 주사기의 단백질 솔루션을 구동 엄지손가락이나 검지 손가락으로 한계에 조립 혼합 장치의 단백질 측면에 플런저를 전진.
- 지질 측면에 플런저 이제 커플러 통해 단백질 주사기로 다시 지질 주사기의 내용을 운전하는 데 사용됩니다.
- 과정은 여러 번 반복되며 때로는 수백 구절 이상 동질 mesophase를 생성해야합니다. 혼합, 커플러를 통해 앞뒤로 물질의 운동 시간에, 고르지 될 수 있고의 시작, 여분의 힘이 혼합 효과에 필요합니다. 초기 혼합은 보통 샘플의 비 균일한 흐려의 개발과 함께합니다. 균질이 진행되는 동안 새로운 입방 mesophase의 시각적 외관이와 마찬가지로, 질감, 더 균일하고 점성 입방 단계의 특성이된다.
- 조건이 적절하고 입방 위상 양식하는 경우, 분산은 주사기의 총구에 광학 투명하게 나타납니다. 따라서 주사기 배럴에 표시가 총신에 mesophase을 통해 명확하게 판독해야합니다.
- 얼음 짧은 시간 동안 주사기 믹서를 배치하여 혼합하는 동안 시료의 아주 약간의 냉각 균질화 및 투명성의 달성을 가속하실 수 있습니다. 그러나, 그것은 샘플을 overcool하지 않는 것이 중요합니다.
- 이 샘플 온도 마찰 가열 3으로 인해 상승시킬 수 있으므로주의가, 혼합 매우 활발한 않도록 주의해야한다.
5 부 : 디스펜서 로딩
- 10 μL 해밀턴 주사기에서 바늘과 플런저를 제거합니다. 장소에 테플론 물미를 남겨주세요.
- 작은 동전의 도움으로 발급기에서 유지 너트를 제거합니다.
- 래칫 팔을 완전히 철회로 주사기를 삽입 -의 플런저 및 바늘없이 - 발급기의 개최 링을 통해.
- 유지 너트, 주사기를 마주 개스킷 측면을 교체하고 주사기의 열린 끝에 단단히 그것을에 나사.
치료는 주사기가 제대로 개최 링과 총신이 래칫 팔에 평행하게 정렬되어 중심 않도록 주의해야한다. 모두 눈으로 판단하실 수 있습니다. 이 두 요구 사항은 누설을 피하기 위해 중요하다. - 그리 퍼 너트 몇 차례 unscrewed와 재밌 링을 통해 플런저을 통과하고, 주사기의 열린 끝을로 플런저를 안내입니다. 완전히 래칫 팔을 놓으면 되죠. 배럴로 플런저를 이동하고 총구에 자유롭게 진정한 여행 있는지 확인하십시오. 그것은 자유롭게 이동 플런저를 촉진하기 위해 가이드 표시줄에있는 나사를 느슨하게하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그것 않는다는 것을 확인하십시오. 는 테플론 팁은 총신의 제로 μL 졸업 마크 일치 때까지 플런저를 우울하게. 가이드 바에있는 나사가 느슨하게 경우, 그것을 retighten와 플런저가 자유롭게 움직이는 것을 다시 확인해.
- 다른 주사기 및 커플러에 mesophase을 전송 제로 μL 졸업 표시 조립 혼합 장치의 한쪽에있는 플런저를 이동합니다.
- 혼합 장치의 빈 주사기를 (장소에서의 물미)를 분리하고 즉시 로드된 주사기를 연결 - 커플러와 함께ttached - 10 μL 분배 주사기의 스레드 종료. 커플링이 완료되는 죄어져 있음의 정도는 이미 언급, 중요합니다.
- 그래서 100 μL 주사기의 플런저를 우울하여 분배 주사기를로드 커플러를 통해 전송 mesophase.
- 분배 주사기의 철강 종료 짧은 평면 스쳐 바늘을 안전하고 조심스럽게 자리에 조여.
- 재밌 반지의 너트를 조이고하여 래칫 팔로 플런저를 클램프. 관리이가 사용할 수 없게 렌더링 플런저를 점수와 변형 수 있듯이, 너트를 통해 - 강화하지 않도록해야합니다. 고정되어 상태에있는 래칫 팔 제공된 여행 범위로 비디오 시연 인치보다 더 이상으로 제한하는 것이 중요합니다. 이 외에도, 플런저는 버클과 배달 실패 수있는 경향이 있습니다.
- 따라서 바늘의 무효 볼륨을 작성하고 바늘을 로딩, 총신의 플런저를 사전에 래칫 드럼 여러 번 놓으면 되죠. 이 단계는 mesophase의 연속 문자열이 바늘 끝에서 나온다 때까지 (최대 10 회) 반복해야합니다.
- 어떤 단백질은 추가 침전제없이 입방 단계에 불안과 같은 결정화 실험은 즉시 시작한다.
6 부 : 결정화 번호판을 설정
- 표면에 다중 잘 결정 플레이트와 coverslip가 로딩의 용이성을 위해 작업 벤치 위에 몇 인치를 제기 플레이스. 표면이 약간 어두울 때 최적의 콘트라스트 및 향상된 가시성을 실현하고 있습니다.
- 침전제 솔루션을 균질하고 튜브를 모자를 벗다. 1 μL로 침전제 분배 pipet을 설정합니다.
- 한 손으로 수직 개최 분배 주사기로 중앙에 직접 잘 넘버 1의 기본 위에 바늘 팁을 위치로 자유롭게 손을 사용합니다. 유리 표면에 mesophase의 볼러스을 추방하기 위해 반복 발급기에서 버튼을 누릅니다. 표준 반복 발급기는 10 μL 주사기와 함께 사용하는 경우 볼러스 볼륨 200 NL 있습니다. 바늘의 끝이 제대로 전달을 위해 우물의 바닥 위에 수백 micrometers보다 더 이상이어야합니다.
- 4 인접 우물은 mesophase, 장소 2 μL pipet 및 표준 일회용 도움말을 사용하여 각 mesophase의 볼러스 위에 침전제 솔루션 1 μL와 함께 로드된 후.
- 가능한 한 빨리으로 균일하게 그들을 커버하기 위해 가득 우물을 통해 정면 coverslip을 넣으십시오. 물이 단단히 밀봉 영향을하려면, 그것은 스페이서 테이프의 끈적끈적한 표면에 노출된 접촉하게 coverslip에 압력을 적용하기 위해 주걱을 사용합니다.
- 접시에있는 모든 우물이로드와 봉인된 때까지 mesophase 및 침전제 분배 과정은 반복 수 있습니다.
- 추적을 위해 명확하게 번호판을 레이블. 라이트에 민감한 단백질은 일반적으로 배양 챔버에서 그들을 배치하기 전에 알루미늄 호일에있는 접시를 포장하여 처리됩니다.
- 보통 20, 온도 제어 챔버에서 접시를 놓습니다 ° C.
- 정기적인 일정에 따라, 20 배 10 목적으로 편광 현미경을 사용하여 결정 성장을위한 우물을 검사합니다. 다음과 같이 저자의 연구실에서 사용하는 일정은 다음과 같습니다 : 일 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 및 60 사후 설치. 조심스럽게 0.14 - mm 두께 샘플 내에서 초점의 깊이를 조정 mesophase의 볼러스을 검사합니다. 시험은 일반 조명과 교차 - polarizers 사이에 모두 완료해야합니다.
7 부 : 대표 결과
결과 결정의 모양은 막 단백질의 고유 색상에 따라 달라질 것이며, 빛의 편광은 검사 (또는 부족)와 조명의 방식과 품질에 사용. 그림 6은 몇 가지 결정 모습을 보여줍니다. 일반 조명과 함께 볼 때 meso의 성장을 자연스럽게 컬러 막 단백질은 그림 6 (패널 B와 D)에 표시된 것과 같은 찾을 수 있습니다. 정상적인 빛으로 볼 때 입방 단계에서 성장을 무색 막 단백질 결정은 그림 6 (패널 E)에 표시된 것과 같은 찾을 수 있습니다. 마지막으로, 편광과 함께 볼 때 meso의 성장 무색 막 단백질 결정은 그림 6 (패널 A와 C)과 같은 찾을 수 있습니다.
구조 결정의 전반적인 프로세스의 다음 단계는 수확 및 cryo - 멋진 결정을하고 그들로부터 X - 선 회절을 기록하고 분석할 수 있습니다. 이러한 주제는 별도의 조브 기사에서 다루지 수 있습니다.
그림 1.와있는 지질 이중층을 보여주는 생물 학적 막의 도식 표현은 단백질의 다양한 위치하고 있습니다.
그림 2. 구조비타민 B 12 수송 단백질, BtuB의 MX이 조브 문서에 그림 meso 방법 6으로 성장 크리스탈을 사용하여 해결.
그림 3. 구조 기능주기 얻기 및 단백질에 대한 전체 구조 정보를 이용에 관련된 단계의 많은을 보여줍니다.
그림 4. 순서는 meso 방식에 의한 막 단백질 결정의 생산에 관련된 단계를 요약한 것입니다. 빨간색 선은 점선으로 둘러싸인만이 이러한 단계는이 조브 문서에 나와 있습니다. 참고 2.
그림 5. 지질 (monoolein) / 물 시스템을위한 단순 온도 작곡 위상 다이어그램. 결정화 실험은 20까지 설정되어 있습니다 ° C 지질이 40 % 수화에서 물을 어디 saturates. 자세한 위상 다이어그램 참조 5 사용할 수 있습니다.
그림 6. lipidic mesophase의 성장을 막 단백질의 결정.
(A) 비타민 B 12 수송 단백질, BtuB 6 모나스에서 (B) II 7 단지 빛을 수확, (C) adhesin / invasin OpcA 8 (D) bacteriorhodopsin 9, (E) 탄수화물 전송. 이미지는 정상적인 빛 (B, D, E)과 교차 polarizers (A, C) 사이의 기록.
Discussion
입방 단계는 변수의 숫자의 변화와 함께 크게 변경할 수있는 섬세하고 역동적인 환경입니다. 그것은 모든 잠재적인 함정을 설명하는 매뉴얼 모드에서 meso의 결정화 실험에의 설치에 대한 설명을 제공하는 것은 불가능합니다. 그러나, 많은 어려움이 비싼 단백질 솔루션에 적용하기 전에 기술을 연습하여 및 믹싱 동안 주사기에 적용된 압력 검토 기능을 사용하여 피할 수 있습니다. 제대로, meso 방법에있는이 단백질의 다양한 결정을 얻을 수의 수가 지속적으로 증가하고있다.
meso의 결정화 실험에서의 설정을 여기에 주어진 설명은 수동 모드에 중점을두고 있습니다. 프로세스 수 있으며, 자주 결정화 조건의 대규모 검사를 필요로 이러한 경우에 결정화 접시의 자동 설치를 용이하게하도록 수정됩니다.
Acknowledgments
가이 작품에 공헌한 많은 사람들이 있고 대부분은 구조와 기능 생물 그룹 팀장 막 과거와 현재 멤버 모두 출신. 모든 우리는 우리의 따뜻한 감사와 감사를 확장합니다. 이 작품은 과학 재단 아일랜드 (07/IN.1/B1836), 건강 (GM75915)의 국립 연구소, 그리고 리머릭 대학에서 부여에 의해 일부 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein solution | Reagent | Various | Various | |
| Lipid (monoolein) | Reagent | Sigma-Aldrich | Various | |
| Precipitant solutions | Reagent | Various | Various | |
| Purified water | Reagent | EMD Millipore | ||
| Pipetting devices | Tool | Pipetman | Various | |
| Disposable pipet tips | Disposable | Pipetman | Various | |
| Gas-tight syringes | Tool | Hamilton Co | 80265 (25-µl) | |
| Syringe tips | Tool | Hamilton Co | 7770-020 (gauge 22) | |
| Narrow bore coupler* | Tool | Hamilton Co | various/EBS-LCP-2 | |
| Repeating dispenser | Tool | Hamilton Co | 83700 | |
| Silanized glass microscope slides | Disposable | Gold Seal | 3010 | |
| microscope coverslips | Disposable | Fisher Scientific | 12-548C | |
| Perforated double-stick spacer tape | Disposable | Saunders Corporation (hole-punched) | NA | |
| Tweezers | Tool | Various | NA | |
| Brayer (roller) | Tool | Fisher Scientific | 50820937 | |
| Chipped ice | Temperature Control | N/A | NA | |
| Tissues | Disposable | N/A | NA | |
| Calculator | Tool | Various | NA | |
| Lab notebook | Tool | Various | NA | |
* Full details for machining your own Narrow Bore Coupler are provided in Reference 3. |
||||
References
- Caffrey, M. Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases. Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases. Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
- Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21, 223-234 (2000).
- Cherezov, V. In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution. J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).
- Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases. J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).
- Cherezov, V. In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin. Proteins. 71, 24-34 (2008).
- Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).
