Summary
Este vídeo muestra cómo obtener hemocitos (células sanguíneas) de la hawaiana calamar bobtail,
Abstract
Estudios sobre el papel del sistema inmune en la mediación de señalización molecular entre bacterias beneficiosas y sus anfitriones tienen, en los últimos años, hizo importantes contribuciones a nuestra comprensión de la co-evolución de los eucariotas con la microbiota presente. La asociación simbiótica entre el hawaiano calamar bobtail,
Protocol
- Preparar 500 mL de 0,22 micras, esterilizada por filtración de agua de mar artificial (FSW, la salinidad de 35 ppt). Filtro de agua de mar artificial o natural a través de un filtro de 0,22 micrones micras para eliminar las partículas y bacterias.
- Anestesiar a un adulto de Hawai bobtail calamar (Euprymna scolopes) mediante la colocación de una solución al 2% de etanol en agua de mar. Colocar el animal en la anestesia por aproximadamente 10 minutos. El calamar dejará de nadar y no responden activamente al tacto. La respiración continua, indicado por el movimiento del manto, y la actividad de los cromatóforos aún deben ser observados.
- Colocar los calamares con la parte ventral hacia arriba en una bandeja de cera de la disección estándar. Sumerja el animal con FSW que contiene 2% de etanol.
- Utilizando un estándar de 200 puntas de pipeta l, retire el embudo y el manto de exponer el principal vaso sanguíneo cefálico ubicada entre los dos ojos.
- Utilizando una aguja estéril jeringa de 1 ml con aguja de calibre 26.5, la punción de los vasos sanguíneos cefálica y retirar entre 50 a 100 l de la hemolinfa. Lugar de la hemolinfa en un tubo estéril de 1,5 ml en hielo.
Nota: Si un animal servirá como un momento de múltiples donantes, sólo retirar 10-20 l de hemolinfa en un momento dado. Devolver el animal a un tanque de agua de mar normal. El animal será revivir a los 30 minutos. - Hemocitos recién recogidas se lavan y se re-suspendió en 500 l de solución de Ringer Squid s (S-Ringer, 530 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 mM MgCl 2, 10 mM CaCl 2 y tampón HEPES 10 mM, pH 7,5).
- Las concentraciones de hemocitos son determinados por hemocitómetro, y aproximadamente 2.000 células se añaden a resbalones cámaras cubierta de vidrio, y permite que se adhieran al vidrio durante 10 minutos a temperatura ambiente. A esta densidad, los hemocitos formar una monocapa uniforme en la superficie de lámina de vidrio.
- Para observar las bacterias unión a hemocitos anfitrión, hemocitos están expuestos a una cepa bacteriana marcado con fluorescencia, como Vibrio fischeri ES114 y / o Vibrio harveyi B392, cada uno con un reportero de verde fluorescente. V. ES114 fischeri y V. harveyi B392 se producen a mitad de la fase de registro en un mar de agua medios triptona (SWT) a 28 ° C en un agitador orbital. La densidad óptica a 600 nm se mide espectrofotométricamente para determinar la densidad celular. Las bacterias se sedimentaron por centrifugación (5.000 rpm durante 5 min), se desecha el sobrenadante y el pellet se resuspendió en S-Ringer.
- 100.000 células bacterianas se añaden a cada cámara y por lo que hay 50 bacterias por hemocitos en promedio. Los hemocitos / mezclas de bacterias se incubaron en solución de Ringer S-s a 25 ° C durante 1 hora, un tiempo determinado para obtener el máximo nivel de la unión.
- El citoplasma de los hemocitos son luego teñidas con fluorescencia CellTracker 0,005% Naranja (Invitrogen) y luego se lavan en el S-Timbres para visualizar las células.
- Hemocitos teñidos con bacterias asociadas son vistos por fluorescencia utilizando un estereoscopio Zeiss Descubrimiento V20 fluorescente o un microscopio láser confocal Leica SP2 espectral, y enumeró toda la superficie de la célula animal.
Resultados representante
Debido a la hemolinfa cefalópodos contiene hemocianina extracelular y no la hemoglobina, la oxigenación, la hemolinfa se vuelve azul oscuro. Un promedio de ~ 5000 hemocitos por l de la hemolinfa se obtiene con este método. Después de la adhesión a la cubierta se desliza la recámara y la tinción fluorescente, los hemocitos debe aparecer brillante fluorescente de color rojo y ameboides en forma. Para la adhesión bacteriana, V. fischeri se adhieren bien a los hemocitos (1-2 células bacterianas por células de la sangre), mientras que V. harveyi se adhieren fuertemente (10-15 células bacterianas por hemocitos).
Figura 1. Adultos Hawaii calamar bobtail Euprymna scolopes muestra la posición de los vasos sanguíneos cefálica.
Figura 2. Resultados de la exposición de hemocitos de Vibrio fischeri (A) y Vibrio harveyi (B). Rojos, glóbulos Rastreador de naranja, verde, GFP-etiquetados bacterias.
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Discussion
Estudios sobre el papel del sistema inmune en la mediación de señalización molecular entre bacterias beneficiosas y sus anfitriones tienen, en los últimos años, hizo importantes contribuciones a nuestra comprensión de la co-evolución de los eucariotas con la microbiota presente. El sistema de squid / vibrio ha demostrado ser un sistema modelo manejable para responder preguntas fundamentales en este campo 2,3,5,6,8. La luz de los órganos del calamar scolopes Euprymna permite la colonización exclusivamente por la bacteria Vibrio fischeri luminoso. Debido a que los tejidos que albergan la bacteria permanece en contacto con agua de mar, el calamar no sólo debe promover la simbiosis específicas, sino también seguir excluyendo a otras bacterias. Continuaron los estudios han revelado que los macrófagos-hemocitos probablemente juegan un papel importante en el establecimiento y mantenimiento de esta asociación 1,4,7. Debido a que el anfitrión calamar carece de la inmunidad adaptativa, la especificidad sorprendente encontrar en esta asociación debe ser total o parcialmente mediada por el sistema inmune innato. Una reciente investigación de estas células de sangre reveló que hemocitos aislados de E. scolopes reconocer y fagocitar V. fischeri y las bacterias no simbióticas diferencial, y es probable que la colonización lleva a un tipo de "tolerancia inmunológica" de los simbiontes 4. Este protocolo se muestra cómo obtener con éxito estas células de sangre de calamar adulto y poner a prueba su capacidad de obligar a las bacterias.
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Acknowledgments
Fuentes de financiación: Universidad de Connecticut, Fundación para la Investigación y el Departamento de Biología Molecular y Celular de SVN, Sigma Xi Grant-in-Ayuda de Investigación y Antonio H. y R. Majorie
Romano de Educación para Graduados de Becas para AJC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab-Tek chambered #1.0 borosilicate coverglass system (8-chambers) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 155411 | |
| 26.5 G 1ml latex-free insulin syringe | BD Biosciences | C34551 | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 | |
| SteREO Discovery V20 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| SP2 Confocal Microscope | Leica Microsystems |
References
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- McFall-Ngai, M. J. Unseen forces: the influence of bacteria on animal development. Dev. Biol. 242, 1-14 (2002).
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