Summary
Restringimento aortico trasversale (TAC) nel topo è un modello comunemente usato sperimentale per studiare meccanismi che sottendono l'ipertrofia cardiaca e scompenso cardiaco sviluppo. Qui si descrivono le modalità per costrizione dell'aorta per creare un grado riproducibile di ipertrofia cardiaca nei topi.
Abstract
Restringimento aortico trasversale (TAC) nel topo è un modello comunemente usato sperimentale per un sovraccarico di pressione indotta ipertrofia cardiaca e scompenso cardiaco.
Protocol
Parte 1: Preparazione del campo operatorio
- Il campo operativo è disinfettata con il 75% di alcool isopropilico.
- Assicurarsi che il pad di riscaldamento è acceso e alla giusta temperatura. Un sistema consigliato è una pompa Gaymar acqua circolante collegato ad un pad terapia che viene mantenuta a 37 ° C ± 1 ° C. E 'importante mantenere la temperatura corporea normale durante l'intervento chirurgico per evitare una rapida diminuzione della frequenza cardiaca.
- Strumenti chirurgici vengono sterilizzati in uno sterilizzatore a caldo perla prima dell'intervento chirurgico. Per questa procedura, avrete bisogno dei seguenti strumenti chirurgici: forbici, pinzette ricurve corso X 2, fine 45 ° angolo X 2 pinze, forbici primavera angolato, retrattore del torace, e porta aghi.
- Applicatori di cotone dovrebbe essere a portata di mano in caso di sanguinamento.
Parte 2: Preparazione e intubazione di topi
- I topi vengono anestetizzati in una camera di induzione con isofluorano al 2% miscelato con 0,5 -1,0 l / min 100% O 2.
- Tosatrici vengono utilizzate per accorciare il pelo dalla scollatura a livello del torace a metà.
- Il mouse è posto in posizione supina in cima a una piastra elettrica al fine di mantenere la temperatura corporea.
- Un elastico viene posizionato sopra i denti anteriori l'animale s di estendere il collo. Utilizzando pinze curve in una mano, la lingua è delicatamente manipolato a lato. Con l'altra mano, l'intubazione endotracheale viene eseguita utilizzando tubi PE 90. Il tubo endotracheale viene poi collegato ad un volume-ciclismo pedalato roditori ventilatore Harvard a 125-150 respiri / minuto e un volume corrente di 0.1-0,3 ml. Durante la procedura chirurgica, l'anestesia viene mantenuta al 1,5-2% isoflurano con 0,5-1,0 L / min 100% O 2. Corretto livello di anestesia è verificata applicando pressione sul letto ungueale del mouse (convergenza pizzico reflex).
- Il campo chirurgico viene disinfettato con una soluzione di Betadine seguito dal 70% di alcol. Questa procedura viene ripetuta tre volte.
- Per prevenire la contaminazione del campo operatorio durante l'operazione, un telino sterile è posta sopra il mouse lasciando solo il campo operatorio esposti.
- Un insieme di guanti sterili viene utilizzato per ogni individuo del mouse.
Parte 3: legatura dell'aorta trasversale
- Toracotomia parziale a seconda costa viene eseguito al microscopio chirurgico e lo sterno ritratta con un divaricatore petto.
- Belle punta a 45 ° pinza angolata sono usati per separare delicatamente il tessuto del timo e il grasso dall'arco aortico.
- A seguito di identificazione dell'aorta trasversale, un piccolo pezzo di una sutura 6,0 seta è posto tra le arterie innominate e carotide sinistra (Figura 1).
- Due nodi sono sciolti legato intorno al aorta trasversali e un piccolo pezzo di un ago calibro 27 ½ ottuso è posto parallelamente alla aorta trasversale. Il primo nodo è legato rapidamente contro l'ago, seguito dal secondo e l'ago prontamente rimossi al fine di ottenere una costrizione di 0,4 millimetri di diametro. Nei topi di controllo sham, l'intera procedura è identica tranne che per la legatura dell'aorta.
- Il retrattore petto viene rimosso e il deflusso del ventilatore pizzicato off per 2 secondi per ri-gonfiare i polmoni.
- La gabbia toracica è chiuso con un 6,0 sutura prolene con un modello sutura interrotta.
- La pelle è chiuso con un 6,0 sutura prolene con un modello di sutura continua.
Parte 4: recupero post-operatorio
- Per analgesia post-operatoria, il mouse viene iniettato con buprenorfina (0,1 mg / kg) per via intraperitoneale. Se ci sono segni di disidratazione dopo l'intervento chirurgico, soluzione salina sterile viene dato via intraperitoneale.
- L'anestesia è gradualmente abbassata in posizione off e il tubo endotracheale rimosso quando segni di respirazione spontanea si verificano.
- Il mouse viene spostato nella posizione prona e ha permesso di recuperare su una piastra elettrica.
Parte 5: Conferma di legatura successo della Aorta trasversale
- Una settimana dopo la TAC, il mouse viene nuovamente anestetizzati per determinare il grado di sovraccarico di pressione indotta dalla legatura dell'aorta trasversale. Come descritto sopra, l'anestesia viene mantenuta al 1,5-2% isoflurano con 0,5-1,0 L / min 100% O 2 e la temperatura corporea a 37 ° C ± 1 ° C.
- A 20 MHz sonda doppler è posto sul lato destro e sinistro del collo in un angolo di 45 ° per rilevare velocità di flusso. Un computer basato su processore di segnale Doppler (Indo Instruments, Houston, TX) è stato utilizzato per visualizzare e memorizzare i segnali Doppler 5.
- A seconda del grado di sovraccarico di pressione necessaria per il protocollo sperimentale, i topi solo con una carotide destra (RC) / carotide sinistra (LC) il rapporto di flusso entro un certo intervallo sono inclusi per ulteriori analisi. Ad esempio, un moderato grado di sovraccarico di pressione porta ad un rapporto di 5-8, mentre una costrizione stretto con conseguente sovraccarico di pressione gravi conduce toa rapporto di 8-10 (Figura 5.3A). Un animale finto (ma non gestite legatura), tuttavia, dovrebbe avere un rapporto di ~ 1 (Figura 5.3b).
6: Risultati Rappresentante
La sopravvivenza tipico chirurgico dopo TAC nei topi wild-type è di circa 80-90%. Successo legatura chirurgica dell'aorta trasversale porterà ad un rapporto di velocità di flusso Doppler tra destra e sinistra dell'arteria carotidea (RC / LC) di 5-10 (Figura 1). Rispetto ai topi sham-operati (Figura 2A), i topi con sovraccarico di pressione sono tenuti a sviluppare l'ipertrofia cardiaca entro 1-2 settimane, e la dilatazione cardiaca dopo 6-8 settimane, a seconda della tenuta della costrizione (Figura 2B). La mortalità durante il primo mese dopo la TAC è generalmente basso (<20%) nei topi wild-type, anche se topi geneticamente modificati possono presentare tassi di sopravvivenza diversi. 6,7
Figura 1. La conferma della legatura Aorta trasversale utilizzando misurazione del flusso Doppler. Rappresentante segnali di velocità Doppler del diritto (RC) e carotide sinistra (LC) arterie 6 giorni dopo la TAC. Queste registrazioni dimostrano una legatura di successo con un RC / LC rapporto tra il flusso di ~ 6.8. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 1.
Figura 2. Immagini rappresentative di tutto cuore Dopo TAC. A. Sham azionati cuore selvaggio del mouse tipo. B. Cuore selvaggio del mouse tipo 16 settimane post-TAC. Ogni linea = 1 mm.
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Discussion
TAC, che imita la stenosi aortica umana, è un metodo comune per indurre l'ipertrofia cardiaca e insufficienza cardiaca nei topi. Siti alternativi per costrizione aortica includono l'aorta ascendente e addominale. Restringimento dell'aorta ascendente fornisce un sovraccarico estrema e più rapido del ventricolo sinistro (LV). Al contrario, la costrizione dell'aorta addominale lascia intatta una porzione più ampia della circolazione come mezzo di eventuale risarcimento. 8 Perciò, TAC è spesso il modello preferito in quanto prevede un adeguato sovraccarico LV in un modo dipendente dal tempo più suscettibili di indagine. Anche se questa procedura può essere tecnicamente impegnativo, con la pratica, abbiamo raggiunto un tasso di sopravvivenza del 80-90% nei topi wild-type.
La tenuta di costrizione aortica trasversale determina il grado di sviluppo ipertrofia e il tempo in cui insufficienza cardiaca e la dilatazione si sviluppa. Inoltre, l'età dei topi colpisce il tasso di recupero e cinetica di sviluppo dell'insufficienza cardiaca. Topi più anziani (> 12 mesi di età) impiegano più tempo a sviluppare una risposta di adattamento delle arterie carotidi a TAC, e sono suscettibili di sviluppare cardiomiopatia dilatativa più veloce di giovani topi (3-4 mesi di età) 5.
Non invasiva intubazione di topi prende una certa pratica. Un metodo alternativo è il seguente:
- Una piccola incisione sulla linea mediana del collo dell'utero è fatto con forbici e tessuti separati intorno alla trachea utilizzando pinze curve in modo da esporre la trachea.
- Un pezzo di sutura è collocato intorno ai denti anteriori e delicatamente tirato via dal corpo dell'animale di estendere il collo.
- Utilizzando pinze curve in una mano, la lingua è delicatamente manipolato a lato.
- Con l'altra mano, l'intubazione endotracheale viene eseguita utilizzando tubi PE 90 smussato sul bordo per facilitare l'entrata.
Il tubo endotracheale viene poi collegato ad un volume-ciclismo pedalato roditori ventilatore Harvard a 125-150 respiri / minuto e un volume corrente di 0.1-0,3 ml.
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Acknowledgments
XHTW è un WM Keck Foundation Scholar Illustri giovani nella ricerca medica, ed è anche supportato da NIH / NHLBI concede R01-R01-HL089598 e R01HL091947 e Distrofia Muscolare associazione concedere # 69238. RJvO è il destinatario della Fellowship dell'American Physiological Society 2008-2010 post-dottorato in Physiological Genomics. Questo lavoro è supportato anche in parte dall'Alleanza Fondation Leducq per CaMKII segnalazione di Cuore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gaymar T/pump | Harvard Apparatus | Model TP-500 | Circulating water pump |
| Temp. therapy pads | Harvard Apparatus | 60-3414 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Blunt scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5980 | |
| Angled spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5668 | |
| Chest retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| Course curved forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5138 | |
| Dumont fine 45° angled forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Electric shaver | GE Healthcare | For shaving mouse fur | |
| PE 90 tubing | BD Biosciences | 427420 | For intubation |
| MiniVent (ventilator) | Harvard Apparatus | Type 845 | |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | May be purchased at medical supply store |
| Sterile gloves | Mckesson | 20-1565 | |
| Stereo microscope | Unico | ZM186 | |
| 6-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| 27 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 6-0 prolene suture | Mckesson | 3286 | |
| Buprenorphine | Institutional Animal Facility |
References
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