Robótica e Análise de Imagem Dinâmica de Estudos de Expressão Gênica em Tecidos Vegetais

Summary

Apresentamos um método para a introdução, acompanhamento e análise quantitativa de expressão GFP em células vegetais. Este método utiliza um design personalizado sistema de robótica para semi-contínua coleção de imagens de um grande número de amostras, ao longo do tempo. Nós também demonstrar o uso de ImageJ e ImageReady para análise de séries de imagens.

Abstract

Expressão de genes em tecidos vegetais é tipicamente estudada por extração destrutiva de compostos de tecidos de plantas para

Protocol

A metodologia a seguir descreve um protocolo para análise de imagem da expressão gênica utilizando um sistema automatizado de recolha de imagem. Para facilitar a explicação, a abordagem geral foi dividido em quatro etapas: 1) preparação de sementes, 2) a introdução de genes utilizando bombardeamento de partículas, 3) coleção de imagens de robótica, e 4) análise de imagem. Embora esta metodologia geral pode ser usada para uma ampla gama de outras aplicações, os conjuntos de presente de protocolos são baseados no uso do gene da proteína fluorescente verde (GFP), que é um gene repórter útil para a expressão do gene de rastreamento na mesma peça de tecidos vivos ao longo do tempo.

I. Preparação de Sementes

1. Lima feijão (. Phaseolus lunatus cv Henderson-Bush) as sementes podem ser comprados, ou, idealmente, colhidas de plantas cultivadas em câmara de crescimento (50% de umidade relativa, 16 / 8 h luz: escuro, 25/23 ° C dia / noite). Pós-colheita de sementes de qualidade pode ser mantida por sementes armazenar a -20 ° C.
2. Prepare Magenta GA7 recipientes para germinar sementes. Papel de filtro vezes ou toalhas de papel para caber no fundo de caixas de Magenta. Adicionar ~ 25 ml de água deionizada para cada recipiente para umedecer toalhas de papel e despeje a água não absorvida. Autoclave papel umedecido contendo caixas por 20 min.
3. Usando 50 ml tubos de centrífuga descartáveis, esterilizar as sementes em uma solução de lixívia a 10% comerciais (20 sementes em 20-40 ml) por 20 min com agitação em um agitador giratório em 60 rpm.
   Nota: Todas as etapas subseqüentes devem ser realizados em uma capela de fluxo laminar.
4. Enxaguar as sementes 4-7 vezes com água deionizada estéril com agitação suave durante 30 segundos durante cada lavagem.
5. Coloque 5-6 sementes estéreis entre as camadas de papel dobrado localizados em cada caixa de Magenta estéril.
6. Incubar as sementes por 4 dias sob as seguintes condições: 25 ° C, 16 / 8 h luz: escuro e 40 μEm ^-2 s ^-1.

II. Introdução de genes usando bombardeio de partículas

1. Construir construções de gene usando seu vetor de expressão favorito com um gene repórter que pode ser monitorado em tecidos vivos. Nós projetamos uma alta de cópia vetor de expressão número útil para promotor e análises elemento promotor. Este vetor contém o gene GFP, que é usado para visualizar promotora / função promotor elemento nos tecidos transformados.
2. Cerca de 1-2 h antes de bombardeio, consumo cotilédones de feijão de lima germinação de mudas e remover o tegumento. Cotilédones adequado para bombardeio deve ser amarelo-luz verde, plana e livre de qualquer dano que possa interferir com análise de imagem adicional.
3. Cotilédones lugar na OMS meio de cultura contendo sais MS ^1, vitaminas B5 ^2, 3% de sacarose e Gelrite 0,2% (pH 5,7) imediatamente depois de ser extirpado.
4. Precipitar o DNA para construir M10 partículas de tungstênio (Sylvania, Towanda, PA, EUA). Em um tubo de microcentrífuga 0,6 ml, adicionar 25 mL partículas de tungstênio (partículas são suspensas em água estéril, 100 mg ml ^-1, logo antes de usar), 5 mL de DNA (1 ml mg ^-1), 25 mL de cloreto de cálcio 2,5 M (Sigma Cat-Aldrich. C3881-500G) e 10 ml 100 mM espermidina (Cat Sigma. S-2626). Vortex brevemente para misturar todos os componentes.
5. Incubar a preparação de DNA em gelo por 5 min. Então, remover e descartar o sobrenadante 50 mL.
6. Ressuspender as partículas de DNA revestido em vórtice e remover imediatamente uma alíquota de 2 mL. Repita este passo vórtice cada vez que uma alíquota é retirada do tubo. Partículas revestidas devem ser mantidos em gelo e usado dentro de 15 min.
7. Através do topo de um filtro de seringa, coloque 2 l partículas revestidas no meio da tela do filtro. Coloque a unidade de filtro que contém as partículas revestido na unidade de fixação do filtro dentro da câmara de arma de partículas.
8. Coloque uma lima feijão lado adaxial dos cotilédones acima em um defletor e coloque o defletor na câmara de arma de partículas. O defletor, que consiste de uma tela derretida para o fundo de um copo, é usado como uma plataforma para apoio tecidos durante o bombardeio.
9. Bombardeiam os tecidos usando uma arma de Partículas (nesta metodologia, usamos um Inflow Gun simples e barata de Partículas ^3, PIG, projetado em nosso laboratório) da seguinte forma; a) abrir a válvula que conduz à vácuo para evacuar a câmara, b) após o vácuo atinge 760 mm (30 pol) Hg, ativar o solenóide e liberar o hélio para impulsionar as partículas, c) depois do bombardeamento de partículas, fechar a válvula da linha de vácuo e liberar o vácuo usando a válvula de escape. A pressão de hélio usado para acelerar partículas é de 50 PSI.
10. Após o vácuo é liberado, abra a porta da câmara para recuperar os cotilédones bombardeados e retornar o cotilédone lado, adaxial up, a OMS meio de cultura.
    
    Nota: Para quantificação e perfil de expressão, normalmente bombardear um mínimo de três cotilédones para cada DNA construir. Um controle positivo, que é geralmente um DNAconstrução que dá um bem estudado perfil de expressão gênica, é incluído como uma referência.

III. Coleta automatizada de imagem

1. Ligue a lâmpada de mercúrio e aguardar 30 min para a lâmpada para aquecer.
2. Ligue as fontes de energia para o Spot-RT câmera CCD (Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, MI, EUA) e da plataforma robótica controlador do motor, que impulsiona o movimento da plataforma robótica.
3. Definir o conjunto de filtro para detecção de GFP (GFP2 conjunto de filtros;.. Nm Ex 480/40, Em 510 LP) em um microscópio de dissecação MZFLIII (Leica, Heerbrugg, Suíça).
4. Esterilizar o espessamento de policarbonato tampas placa de Petri por aspersão com etanol 70%. As tampas especializado, usado para cobrir a base placa de Petri evitar a condensação durante a coleta de imagens ^4.
5. Coloque as placas contendo cotilédones bombardeados na plataforma robótica (Arrick Robotics, Hurst, TX, EUA) do sistema automatizado de imagem coleção. A plataforma robótica é impulsionado por um conjunto motor de passo e consiste de uma mesa para fixação de 8 placas de Petri. A plataforma é construída em policarbonato, polipropileno e alumínio. Placas são fixadas na posição apertando um plástico laterais parafuso de fixação.
6. Abra o aplicativo de software personalizado que controla tanto a plataforma robótica e de aquisição de imagem. Além disso, abra o software controlador de interruptor de luz branca.
7. No "movimento do motor", clique em "motor ligado" e "motor home". Depois que o software orienta a plataforma para a posição inicial, estamos prontos para começar a introduzir posições para cada cotilédone.
8. No "movimento do motor", selecione a primeira placa. A plataforma será a posição do centro da placa de Petri no âmbito do objectivo do microscópio. Usando os botões de distância em movimento, precisamente a posição do cotilédone primeira coleção de imagens. Com o controlador de luz branca em diante, a região de destino pode ser observado através do monitor de computador ligando o "live mode" recurso.
9. Para o cotilédone em primeiro lugar, definir o foco e ampliação (ampliação 1.6x é o preferido), utilizando os botões do manual sobre o microscópio de dissecação. Foco ajustes para os cotilédones restantes no mesmo prato são feitos por meio de três parafusos de nivelamento localizados abaixo de cada prato, sobre a plataforma robótica.
10. Uma vez que a região de interesse foi definida, clique no botão "adicionar esta posição" botão. O software irá adicionar as coordenadas da região a um arquivo de agendamento posição ea plataforma irá retornar para o centro da placa.
11. Conjunto de posições e foco de todas as restantes cotilédones em pratos utilizando os botões de distância em movimento e parafusos de nivelamento manual. Depois de todas as coordenadas de todos os cotilédones foram inseridos, gravar as coordenadas cronograma posição.
12. Inserir os parâmetros coleção de imagens. Na "imagem definição", selecione o tipo de luz desejada, branco ou azul. Para a detecção de GFP, apenas a luz azul deve ser usado. Digite também a definição de exposição. Apesar de podermos modificar o tempo de exposição, independentemente de cor vermelha, azul e verde, que normalmente usam as mesmas configurações para GFP foto-documentação (20, 14 e 14 seg para o canal vermelho, verde e azul, respectivamente) o que nos permite fazer diretos e comparações consistentes entre construções de DNA diferentes.
13. Na "imagem setting" mesmo guia, especifique uma pasta vazia onde as imagens serão armazenadas. Cada série de imagens serão salvas dentro dessa pasta mestre em pastas independentes, numerados seqüencialmente de acordo com a ordem das posições são para os cotilédones.
14. Vá para a "captura de controle de tempo" guia e definir a imagem intervalo de tempo de aquisição e número total de ciclos de coleta de imagem. As imagens são geralmente coletadas a cada hora para 100 h, gerando bem definidos perfis de expressão gênica.
15. Iniciar a aquisição da imagem clicando em "agenda correr!" botão localizado na "posição cronograma" guia.
16. No final da coleção de imagens 100 h, a transferência de todas as imagens do computador que controla o robô para qualquer unidade de grande capacidade de disco rígido ou computador para análise de imagem adicional. Imagens de alta resolução (1600 x 1200 pixels) são coletadas como TIF arquivos medição ~ 5 Mb cada.

IV. Análise de Imagem

1. Montar o 100 imagens seqüenciais de cada pasta usando o Adobe ImageReady.
   1. Abra ImageReady e importar todas as imagens seqüenciais que compõem uma série de quadros.
   2. Redimensionar imagens originais de 800 x 600 pixels. Imagens coletadas são de alta resolução, que gera arquivos grandes que podem tornar o processamento de imagem lento.
   3. Percorrer as imagens e encontrar um ponto (s) visível na maioria das imagens.
   4. Zoom de até 300% no local selecionado (s). Alinhamento de imagens usando maior ampliação permite um registro mais preciso.
   5. Inserir uma camada em cima de todas as imagens e certifique-se visível em todos os quadros. Marcar o ponto de localização (s) usando o "pincel" ferramenta.
   6. Começar a alinhar todos os quadros utilizando o "move" ferramenta e tendo as marcas sobre a camada como uma referência.
   7. Quando o alinhamento for concluído, delete a camada usada como referência e guardar as imagens como um único arquivo "PSD". Além disso, exportar todos os quadros como "mov" único arquivo utilizando a mais alta resolução. Alinhamento manual de cada série de imagens leva ~ 10 min.
2. Realizar a quantificação da expressão gênica usando ImageJ.
   1. Abra o software ImageJ e abrir o "mov" arquivo salvo anteriormente no ImageReady.
   2. Usando a ferramenta de selecionar, escolher uma área de 400 x 300 pixel e recortar a imagem. Este novo arquivo deve ser salvo como um "avi" arquivo.
   3. Separe as imagens seqüenciais, localizado no "avi" novo arquivo em canais vermelho, azul e verde, clicando em "imagem", "cor" e "split RGB" no ImageJ.
   4. Subtrair a fluorescência de fundo de todas as imagens nos canais verde e vermelho. Usando a série de canal verde da imagem, selecionar uma área de 20 x 20 pixels de uma região com os não-células que expressam e registrar sua localização no "Gerenciador de ROI" ferramenta, para que a mesma área serão selecionados em ambos os canais. Com os 20 x 20 pixel quadrado ativo no canal verde, vá para o comando "plugins" localizado na barra de tarefas do ImageJ e depois clique em "subtrair ROI medido para cada fatia" plugin-ferramenta.
   5. No ImageJ, clique em "Imagem", "ajustar" e então "limite" para definir o segmento ou expressando GFP-pixels. Ajustar os níveis de threshold arrastando a barra na janela do limite para obter um tamanho de ponto média de 20-30 pixels.
   6. Determinar a expressão GFP usando um plugin que nós projetamos para medir a média em tons de cinza por pixel valor eo número total de GFP-expressando pixels.
   7. Copiar a saída em tons de cinza significa valores em ImageJ e cole em Microsoft Office Excel. Calcular a expressão GFP para cada canal (vermelho e verde) através da multiplicação da média em tons de cinza por pixel valor pelo número total de GFP-expressando pixels para cada canal. A soma dos valores de expressão para ambos os canais dá a expressão GFP. Valores podem ser usados ​​para ilustrar perfis de expressão gênica e fazer comparações diretas. Lapso de tempo animações também podem ser gerados usando "mov" ou "avi" arquivos, proporcionando uma visualização única e clara do perfil de expressão gênica.

Representante Resultados V.

A coleta e análise de imagem robótica procedimento (Fig. 1) relataram aqui permite a aquisição de uma grande quantidade de dados quantitativos sobre a expressão do gene em um curto período de tempo. Para a caracterização de plantas promotor usando o gene GFP, esta metodologia não só é útil para criar perfis de expressão transitória (Fig. 2), mas também a pista em uma expressão de GFP maneira detalhada em transitoriamente e tecidos da planta estavelmente transformada ^5,6. Curto lapso de tempo animações geradas com as imagens coletadas seqüenciais são uma ferramenta valiosa para análises em profundidade da expressão gênica ao longo do tempo nos tecidos vegetais. Esta metodologia também tem grande aplicação para avaliar os fatores que afetam diretamente a expressão do gene. Por exemplo, a expressão GFP transitória sob a presença de supressores diferentes de silenciamento de origem viral tem sido estudada com sucesso usando nossa coleção de imagens automatizadas e sistema de análise de ^7,8.

Figura 1. Procedimento de análise de imagem consiste em quatro etapas principais. (A) Aquisição de série de imagens usando o sistema de coleta de robótica imagem, (B) a separação das imagens em canais vermelho, azul e verde, (C) segmentação dos pixels expressar ajustando os níveis de limiar, e (D) a obtenção dos resultados de saída contendo os tons de cinza e os valores expressando GFP-contagem foco.

Figura 2. Gráfico mostrando diferentes perfis de expressão transitória impulsionada pelos promotores de plantas fundido a GFP. Os dados foram coletados através do nosso sistema de coleta de robótica imagem e analisados ​​com ImageReady e software ImageJ.

Discussion

O uso da robótica tem aplicações enormes em diferentes aspectos da vida humana, especificamente, os robôs foram efetivamente utilizados para realizar atividades em ambientes perigosos, para automatizar as atividades tedioso e complexo, e para realizar tarefas de forma mais precisa. Em biologia molecular e, especificamente, as análises de expressão gênica, os robôs podem ajudar a controlar não apenas as características dos genes, mas também o crescimento de tecido e desenvolvimento ao longo do tempo. Muitos fenômenos biológicos ocorrem de forma dinâmica, que pode ser difícil de seguir por meio de observações único ponto do tempo.

O uso do gene GFP para estudos de expressão traz vantagens adicionais para observar a resposta tecidual e crescimento. Para os nossos procedimentos experimentais, GFP nos permite acompanhar a expressão do gene na mesma peça de tecido ao longo do tempo como detecção de GFP é um não-destrutivo. Além disso, a nossa versão da proteína GFP é suficientemente estável para permitir a detecção, mas também mostra algumas volume de negócios para minimizar a acumulação nos tecidos da planta, permitindo-nos acompanhar a ascensão e queda da expressão gênica.

Nós já utilizaram nosso colecção de imagens robótica e sistema de análise para uma ampla gama de aplicações. Prevemos um elevado potencial para muitas aplicações biológicas, onde uma compreensão da dinâmica de um fenômeno é desejada. Por exemplo, o crescimento eo desenvolvimento dos tecidos vegetais podem ser rastreados usando o nosso sistema dando insights valiosos / informação sobre estes processos. Além disso, a dinâmica do transporte de proteínas usando genes repórter como GFP, pode ser facilmente visualizado utilizando lapso de tempo animações. A metodologia descrita neste relatório é tecnicamente complexo, mas conceitualmente simples. Nossos resultados são robustos e novas aplicações estão continuamente a ser descoberto.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ	Software	National Institutes of Health		http://rsbweb.nih.gov/ij/