Summary
אנו מדגימים את השירות של זרימת cytometry ססגוניות אפיון פנוטיפי ופונקציונלי מפורט הכולל, כמו גם תת זיכרון מסוג CD4 + ו - CD8 + T תאים של קופי רזוס, המודל האידיאלי עבור HIV / איידס מחקרים החיסון.
Abstract
המודל מקוק רזוס היא כיום מודל זמין הטוב ביותר עבור איידס ביחס להבנת הפתוגנזה, כמו גם לפיתוח חיסונים ותרופות
Protocol
הנהלים עבור ניתוחים פנוטיפי ופונקציונלי מפורט הכולל, כמו גם תת זיכרון ותאי T ניתן לחלק לארבעה חלקים: 1) הכנה Cell וגירוי antigenic, 2) סמן Surface מכתים, 3) מכתים ציטוקינים תאיים ו 4) cytometry זרימה מנתח.
1. תא הכנה גירוי antigenic
- שניהם מבודדים טרי וכן cryo-נשמר בתאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMC) היו בשימוש בפרוטוקול זה. PBMC היו מבודדים heparinized או citrated דגימות דם ורידי של קופי רזוס ידי שקיעה צפיפות שיפוע באמצעות Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, סיגמא אולדריץ, ST. לואיס, מיזורי). Aliquots של PBMC אוחסנו קפוא FCS 90% ו 10% DMSO חנקן נוזלי.
- בעת שימוש cryo-נשמר PBMC, צלוחיות של PBMC קפוא הוסרו חנקן נוזלי מופשר במהירות באמבט מים C 37, מעורב בעדינות, לשטוף עם RPMI-1640 (HyClone מעבדות, לוגן, UT) להסיר את אמצעי מקפיא מחדש מושעה בתקשורת להשלים [CM; RPMI-1640 עם תוספת של 10% חום מומת FCS (HyClone מעבדות), 2mm L-גלוטמין (סיגמא אולדריץ '), 100U/ml פניצילין / סטרפטומיצין (Invitrogen), תרבותי 6 - גם תרבות צלחות רקמת לילה בשעה 37 ° C באווירה CO humidified 5% 2. למחרת בבוקר, ספירת תאים קיימא נקבעו על ידי שיטת trypan כחול החרגה לצבוע מחדש תלויה CM.
- התאים טופלו בצורה שונה הלא ספציפית, לעומת גירוי אנטיגן ספציפי ואחריו מנתח ציטוקינים: (א) גירוי לא ספציפי עם phorbol 12-13-myristate אצטט (PMA) ו Ionomycin (אני) (סיגמא אולדריץ, רח' לואיס, מיזורי), aliquots של תאים בהיקף של 0.1ml (1.0 x 10 6 תאים / טוב) היו מצופה בבארות בודדים של 96-היטב בתרבות צלחות רקמות (BD Biosciences, פרנקלין האגם, NJ). PMA ו Ionomycin שימשו בריכוז הסופי של 50ng/ml ו 500ng/ml, בהתאמה. ההיקף הכולל הסופי 96-היטב צלחת רקמה תרבות 0.2ml/well: (ב) גירוי אנטיגן ספציפי, 1.0 x 10 6 תאים בנפח 1.0 מ"ל היו מצופה בבארות בודדים של 24 צלחות טוב בתרבית רקמה (BD Biosciences , אגם פרנקלין, ניו ג'רזי), שם היו בארות טרום טיפול כפי שתואר לעיל עם שינוי 9. בקצרה, 24 היטב את התרבות צלחות רקמה היו מצופים 2.5 מיקרוגרם / מ"ל / גם אנטי עכבר עז IgG (H + L) (קירקגור ופרי מעבדה, Gaithersburg, MD) בתמיסה טריס 50mm (PH 8.6) עבור 4 ° C בן לילה. למחרת בבוקר צלחות נשטפו פעמיים עם PBS סטרילי ושיתוף גירוי MAB CD49d, לשבט 9F10 (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) נוספו על 10 מיקרוגרם / מ"ל / ואחריו גם על ידי דוגרים במשך שעה אחת על 37 ° C. לאחר דגירה, צלחות נשטפו פעמיים בטמפרטורת החדר עם PBS סטרילית. אנטיגנים של עניין (כולל קוקטייל של שישה פפטידים HIV המעטפה 8 נוספו בריכוז הסופי של 10μg/ml של פפטיד זה. בארות נוספים עם תאים CM לבד הוכנו כביקורת שלילית. ההיקף הכולל הסופי גם כל אחד 24 , גם תרבות צלחת רקמות היה 1.0 מ"ל.
- התאים היו בתרבית במשך 6 שעות 37 ° C באווירה CO humidified 5% 2. Brefeldin (סיגמא אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי) נוספה לתרבות ב 10μg/ml עבור 4.5 השעות האחרונות של גירוי. כתוצאה מכך, התאים הועברו 5 צינורות פוליפרופילן מ"ל ורחץ עם קר (4 ° C) לשטוף חיץ זרימה (PBS Dulbecco של (DPBS, Ca 2 / Mg 2 ללא; טכנולוגיות החיים, Rockville, MD) עם 2% חום מומת FCS), ומעובד לאחר מכן על מכתים עם נוגדנים שונים שכותרתו פלואורסצנטי.
2. משטח סמנים immunofluorescence מכתים
- גירוי התאים היו מוכתמים הראשון עם 4 1ul צבע חי / מת אקווה ניתן לתקן תגובתי פלורסנט ° C בחושך במשך 30 דקות, לשטוף פעם אחת עם חוצץ זרם קר לשטוף.
- לאחר מכן, בעקבות טיטרציה כראוי הקרינה שכותרתו נוגדנים חד שבטיים נוספו תאים: אנטי CD3 PE-Cy7 (SP34-2), אנטי CD8 Alexa700 (RPA-T8), CD28 אנטי PerCP-cy5.5 (L293) , אנטי CD95 APC (DX2) ואנטי CD4 פסיפיק בלו (OKT4), כולם מקבוצת BD Biosciences (פרנקלין האגם, ניו ג'רזי), למעט CD4 פסיפיק בלו (OKT4) מ eBioscience (סן דייגו, קליפורניה). התאים הודגרו במשך 30 דקות ב 4 ° C בחושך.
- עבור כל ניסוי גם פיצוי בקרות הקרינה מינוס אחד (FMO) שולטת 10,11 נוצלו. שולטת פיצוי נוצלו כדי לקבוע את coeffecients גלישה של כל אדם כתם לתוך גלאי אחרים. במשך שולטת פיצוי, מערכת שלמה של צינורות המכיל השעיות תא מאחד קוף הוכתמו פלורסנט MAB מצומדות בנפרד כמו כתמי צבע יחיד. FMO הוא שילוב מכתים ססגוניות המכיל את כל ריאגנטים אבל זה עניין משמש כדי לקבוע את הגבול בין חיוביהאוכלוסייה nd שלילי על ידי שכפול אוטומטי פלואורסצנציה ברמה מוצגים נתונים במדגם מוכתם לגמרי.
- תאים ויטראז נשטפו אז עם חיץ תזרים קר לשטוף, וכן קבוע פתרון קיבעון / permeabilization (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) במשך לפחות 10 דקות (בשלב זה התאים ניתן לאחסן לילה בשעה 4 ° C בחושך) לפני ביצוע מכתים ציטוקינים תאיים.
3. ציטוקינים תאיים מכתים
- תאים קבוע נשטפו עם חיץ לשטוף לזרום, ואז פרם / לשטוף חיץ (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) נוספה על פי ההוראות של היצרן. בקצרה, התאים הודגרו ב 0.1ml של פרם 1X / לשטוף חיץ במשך 10 דקות ב 4 ° C בחושך.
- כתוצאה מכך, התאים הודגרו עם טיטרציה בהתאם FITC שכותרתו אנטי IFN-γ (B27) ו-PE שכותרתו נגד IL-2 (MQ1-17H12) במשך 60 דקות 4 ° C בחושך.
- ואז התאים נשטפו פעמיים נוספות עם פתרון permeabilization
- לאחר לשטוף הסופי, התאים היו מחדש תלויה paraformaldehyde 1% ו DPBS נתון ניתוח cytometry זרימה בתוך 24 שעות.
4. Cytometry ניתוח תזרים
- התאים מוכתם נרכשו על השנייה LSR זרימה cytometer (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) או ציאן ADP (Dako, Carpinteria, CA). נתונים FACS נותחו באמצעות תוכנה FlowJo (עץ הכוכבים, Ashland, OR).
- איור. 1 מציג את תכנית gating מנוצל עבור ניתוחים של תא T תת שונים מן החי נציג. לימפוציטים היו מגודרת first באמצעות פיזור קדימה (FSC) לעומת פיזור צד (SSC), ולאחר מכן לימפוציטים לחיות זוהו מבוסס על SSC ו אקווה שלילי באוכלוסייה. בתאי T ואז היו מזוהים באופן חיובי על ידי ביטוי CD3 ואחריו זיהוי של CD4 + CD8-(תאים מסוג CD4 + T) CD4 ו-CD8 + (+ CD8 ותאי T) אוכלוסיות בתוך CD3 + T האוכלוסייה התא. CD4 + ו - CD8 + T תאים הובחנו נוספת על בסיס של CD28 ו CD95 ביטוי כמו נאיבי (Tn, CD28 + CD95-), הזיכרון המרכזי (TCM, + CD95 + CD28) וזיכרון מפעיל (TEM, CD28-CD95 +) התאים לתוך תת שונים המתואר בספרות 5, 10.
- איור. 2 מראה כיצד קבוצות משנה שונות של CD4 + ו - CD8 + T תאים הוערכו על יכולת תפקודית במונחים של ייצור ציטוקינים (INF-γ ו / או IL-2) בתגובה לגירוי עם PMA ו ionomycin (PMA + I).
5. נציג FACS נתונים
הרכב PBMC ב קופי רזוס נקבע באמצעות ניתוח FACS. איור 1 מציג את ערכת gating מנוצל עבור ניתוחים של תא T תת שונים מן החי נציג. לימפוציטים היו מגודרת first באמצעות פיזור קדימה (FSC) לעומת פיזור צד (SSC), ולאחר מכן לימפוציטים לחיות זוהו מבוסס על SSC ו אקווה שלילי באוכלוסייה. בתאי ה-T זוהו לאחר מכן על ידי ביטוי CD3. CD4 + CD8-(תאים מסוג CD4 + T) CD4 ו-CD8 + (+ CD8 ותאי T) אוכלוסיות בתוך CD3 + T האוכלוסייה תא נקבעו גם. כפי שניתן לראות בתרשים 2, CD4 + ו - CD8 + T תאים הובחנו נוספת על בסיס של CD28 ו CD95 ביטוי כמו (CD28 TN, + CD95-) נאיבי, הזיכרון המרכזי (TCM, CD28 + CD95 +) וזיכרון מפעיל (TEM לתוך תת שונים, CD28-CD95 +) תאים. 2A איור מראה INF-γ ו - IL-2 ייצור CD4 unstimulated ו PMA / ionomycin מגורה + בתאי T, ו - תת, ו -2 איור מראה INF-γ ו - IL-2 ייצור unstimulated ו PMA / ionomycin מגורה CD8 + בתאי T, וכן תת הערה הפרופילים ציטוקינים שונים שהושרו על ידי גירוי בתוך כל קבוצת משנה.
באיור 1. אסטרטגיה gating המשמש ניתוח תזרים cytometric הרכב PBMC ב רזוס macqaues. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.
איור 2. (א) ייצור ציטוקינים פרופיל של CD4 + הכולל בתאי T תת. (ב) ייצור ציטוקינים פרופיל בסך הכל התאים CD8 + T ו - תת. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של 2a, או כאן לגרסה גדולה יותר של 2b דמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ד"ר פרמוד Nehete וגברת Bharti Nehete דם מקוק דגימות PBMC; עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי כספים NIH מענק AI 46969, וכל תרבות התקשורת התא הופקו על ידי התקשורת המרכזית מעבדה, אשר ממומנת על ידי מענק NIH CA 16672.
Materials
Solution and Buffers |
|||
|
|||
Activation agents |
|||
|
|||
Cytokine secretion inhibitors |
|||
|
|||
Antibodies |
|||
|
References
- Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68, 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68, 4650-4655 (1994).
- Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque. Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).
- Pitcher, C. J. Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque. J Immunol. 168, 29-43 (2002).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).
- Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes. J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).
- Gauduin, M. C. Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques. J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).
- De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 11-color 13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat Med. 7, 245-248 (2001).
- Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).
