Summary
Nous démontrons l'utilité de la cytométrie en flux multicouleur pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle détaillée du total des sous-ensembles ainsi que la mémoire des lymphocytes CD4 + et CD8 + T dans les macaques rhésus, le modèle idéal pour les études de vaccin contre le VIH / SIDA.
Abstract
Le modèle macaque rhésus est actuellement le meilleur modèle disponible pour le VIH-sida à l'égard de la compréhension de la pathogenèse, ainsi que pour le développement de vaccins et de thérapeutiques
Protocol
Les procédures pour les analyses détaillées phénotypiques et fonctionnels du total des sous-ensembles ainsi que la mémoire des lymphocytes T peut être divisé en quatre parties: 1) la préparation des cellules et la stimulation antigénique, 2) coloration marqueur de surface, 3) coloration des cytokines intracellulaires et 4) La cytométrie en flux analyses.
1. Préparation des cellules et la stimulation antigénique
- Les deux fraîchement isolées ainsi que la cryo-préservé les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ont été utilisés dans ce protocole. Les PBMC ont été isolées à partir hépariné ou citraté échantillons de sang veineux des macaques rhésus par sédimentation en gradient de densité utilisant Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, ST. Louis, MO). Des aliquotes de PBMC ont été conservés congelés dans 90% de SVF et 10% de DMSO dans l'azote liquide.
- Lorsque vous utilisez la cryo-préservé PBMC, les flacons de produits congelés PBMC ont été retirés de l'azote liquide et rapidement décongelés dans un bain d'eau à 37 C, mélanger doucement, lavée avec du RPMI-1640 (HyClone laboratoires, Logan, UT) pour éliminer le milieu de congélation et remis en suspension dans des milieux complets [CM; RPMI-1640 de compléter avec 10% de la chaleur-FCS inactivé (HyClone laboratoires), 2 mM L-glutamine (Sigma-Aldrich), 100U/ml pénicilline / streptomycine (Invitrogen), et cultivées dans 6 - ainsi des plaques de culture tissulaire nuit à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée 2 5% atmosphère. Le lendemain matin, les cellules viables ont été déterminés par la méthode de trypan bleu exclusion de colorant et re-suspendu dans CM.
- Les cellules ont été traitées différemment des non-spécifique contre l'antigène spécifique de stimulation suivie par des analyses de cytokine: (a) Pour les non-spécifique de stimulation par le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) et de l'ionomycine (I) (Sigma-Aldrich, Saint- Louis, MO), des aliquotes de cellules dans un volume de 0,1 ml (1,0 x 10 6 cellules / puits) ont été étalées dans des puits individuels de plaques de 96 puits de culture tissulaire (BD Biosciences, Franklin Lake, New Jersey). Le PMA et ionomycine ont été utilisés à une concentration finale de 50ng/ml et 500ng/ml, respectivement. Le volume final total pour plaque de 96 puits de culture de tissus est 0.2ml/well: (b) Pour la stimulation spécifique de l'antigène, 1,0 x 10 6 cellules dans un volume de 1,0 ml ont été étalées dans des puits individuels de plaques de 24 puits de culture tissulaire (BD Biosciences , Franklin Lake, New Jersey), où les puits ont été pré-traitées, comme décrit précédemment avec modification 9. En bref, les plaques de 24 puits de culture de tissus ont été recouvertes avec 2,5 ug / ml / puits de chèvre anti-souris IgG (H + L) (Kierkegaard et Perry laboratoire, Gaithersburg, MD) dans du Tris 50 mM solution (pH 8,6) pour 4 ° C pendant la nuit. Le lendemain matin les plaques ont été lavées deux fois avec du PBS stérile et de co-stimulation mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences, San Jose, CA) ont été ajoutés à 10 ug / ml / puits suivie par une incubation d'une heure à 37 ° C. Après l'incubation, les plaques ont été lavées deux fois avec du PBS stérile à température ambiante. Les antigènes d'intérêt (incluant le cocktail de six peptides d'enveloppe du VIH 8 ont été ajoutés à une concentration finale de 10μg/ml de chaque peptide. Puits avec des cellules supplémentaires au CM seuls ont été préparés comme contrôle négatif. Le volume total final pour chaque puits sur les 24 bien-plaque de culture de tissus a été de 1,0 ml.
- Les cellules ont été cultivées pendant 6 heures à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée 2 5% atmosphère. Bréfeldine A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a été ajoutée à la culture à 10μg/ml pour la finale 4,5 heures de stimulation. Par la suite, les cellules ont été transférées à 5 tubes en polypropylène ml et lavé avec de froid (4 ° C) de tampon de lavage de flux (PBS Dulbecco (DPBS, Ca 2 / Mg 2-libres; Life Technologies, Rockville, MD) avec 2% inactivé à la chaleur FCS), puis traitées pour la coloration avec les différents anticorps marqués par fluorescence.
2. Marqueurs de surface immunofluorescence coloration
- Cellules stimulées ont d'abord été colorés avec 1UL vivants / morts fixable Aqua colorant réactif fluorescent à 4 ° C dans l'obscurité pendant 30 minutes, lavé une fois avec le tampon de flux lavage à froid.
- Ensuite, les éléments suivants appropriée titré marqué par fluorescence des anticorps monoclonaux ont été ajoutés à des cellules: l'anti-CD3 PE-Cy7 (SP34-2), anti-CD8 Alexa700 (RPA-T8), anti-CD28-PerCP Cy5.5 (L293) , anti-CD95 APC (DX2) et anti CD4 Pacific Blue (OKT4), tous de BD Biosciences (Franklin Lake, New Jersey), à l'exception de CD4 bleues du Pacifique (OKT4) de eBioscience (San Diego, Californie). Les cellules ont été incubées pendant 30 minutes à 4 ° C dans l'obscurité.
- Pour chaque expérience à la fois la rémunération de contrôle et de fluorescence moins un (FMO) contrôle 10,11 ont été utilisés. Contrôle d'indemnisation ont été utilisés pour déterminer les retombées coeffecients de chaque individu tache dans d'autres détecteurs. Pour les commandes de compensation, un ensemble complet de tubes contenant les suspensions cellulaires de l'un des singes ont été colorés avec fluorescents conjugués AcM individuellement comme des taches de couleur unique. FMO est une combinaison coloration multicolore qui contient tous les réactifs, mais celui de l'intérêt et est utilisé pour déterminer la frontière entreune population positive et négative en dupliquant auto-fluorescence niveau et des données présentes dans l'échantillon entièrement colorées.
- Les cellules colorées ont ensuite été lavées avec du tampon de flux lavage à froid, et fixé dans la fixation / perméabilisation solution (BD Biosciences, San Jose, CA) pour au moins 10 minutes (à ce stade, les cellules peuvent être stockés une nuit à 4 ° C dans le noir) avant d'effectuer coloration des cytokines intracellulaires.
3. Coloration des cytokines intracellulaires
- Les cellules fixées ont été lavées avec un tampon de lavage de débit, puis de Perm / Wash buffer (BD Biosciences, San Jose, CA) a été ajoutée selon les instructions du fabricant. Brièvement, les cellules ont été incubées dans 0,1 ml de Perm 1X / tampon de lavage pendant 10 minutes à 4 ° C dans l'obscurité.
- Par la suite, les cellules ont été incubées avec la façon appropriée titré marqué FITC anti-IFN-γ (B27) et PE-anticorps anti-IL-2 (17h12-MQ1) pendant 60 minutes à 4 ° C dans l'obscurité.
- Puis les cellules sont lavées deux fois avec la solution de perméabilisation
- Après le lavage final, les cellules ont été remises en suspension dans du paraformaldéhyde à 1% dans DPBS et soumis à une analyse par cytométrie de flux dans les 24 heures.
4. L'analyse par cytométrie en flux
- Les cellules colorées ont été acquises sur un flux de LSR II cytomètre (BD Biosciences, San Jose, CA) ou cyan ADP (Dako, Carpinteria, CA). Les données ont été analysées par FACS en utilisant le logiciel FlowJo (Arbre Star, Ashland, OR).
- Figure. 1 montre le schéma de déclenchement utilisé pour les analyses des différents sous-ensembles de lymphocytes T provenant d'un animal représentant. Les lymphocytes ont d'abord été fermée par l'intermédiaire diffusion vers l'avant (FSC) par rapport à diffusion latérale (SSC), puis les lymphocytes vivants ont été identifiés sur la base de PVC et d'aqua-négative de la population. Les cellules T ont ensuite été positivement identifié par le CD3 expression suivie par la détection des cellules CD4 + CD8-(cellules T CD4 +) et CD4-CD8 + (cellules T CD8 +), les populations dans le CD3 + population de cellules T. Les cellules CD4 + et CD8 + ont encore été distingués dans différents sous-ensembles sur la base de CD28 et CD95 expression naïve (Tn, CD28 + CD95-), la mémoire centrale (TCM, CD28 + CD95 +) et la mémoire effecteur (TEM, CD28-CD95 +) des cellules que décrits dans la littérature 5, 10.
- Figure. 2 montre comment les différents sous-ensembles de cellules CD4 + et CD8 + T ont été évalués pour la capacité fonctionnelle en termes de production de cytokines (INF-γ et / ou l'IL-2) en réponse à une stimulation par PMA et ionomycine (PMA + I).
5. Représentant des données FACS
Composition de PBMC en macaques rhésus été déterminée en utilisant une analyse FACS. La figure 1 montre le schéma de déclenchement utilisé pour les analyses des différents sous-ensembles de lymphocytes T provenant d'un animal représentant. Les lymphocytes ont d'abord été fermée par l'intermédiaire diffusion vers l'avant (FSC) par rapport à diffusion latérale (SSC), puis les lymphocytes vivants ont été identifiés sur la base de PVC et d'aqua-négative de la population. Les cellules T ont ensuite été identifiés par CD3 expression. CD4 + CD8-(cellules T CD4 +) et CD4-CD8 + (cellules T CD8 +), les populations dans le CD3 + population de cellules T ont également été déterminées. Comme le montre la figure 2, les CD4 + et CD8 + ont encore été distingués dans différents sous-ensembles sur la base de CD28 et CD95 expression naïve (Tn, CD28 + CD95-), la mémoire centrale (TCM, CD28 + CD95 +) et la mémoire effecteur (TEM, CD28-CD95 +) des cellules. Figure 2A montre l'INF-γ et IL-2 de production de CD4 non stimulées et PMA / ionomycine stimulé les cellules T, et sous-ensembles, et la figure 2B montre INF-γ et d'IL-2 dans les cellules T non stimulées et PMA / ionomycine stimulé CD8 +, et sous-ensembles Notez les profils de cytokines distincts provoqué par la stimulation de chaque sous-ensemble.
Figure 1. Gating la stratégie utilisée pour l'analyse par cytométrie en flux de composition PBMC rhésus macqaues
Figure 2. (A) le profil de production de cytokines de cellules CD4 + au total des cellules T et des sous-ensembles. (B) Profil de la production des cytokines du total des cellules T CD8 + et des sous-ensembles.
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Acknowledgments
Dr Pramod Nehete et Mme Bharti Nehete pour le sang et les échantillons de PBMC de macaques; Ce travail a été partiellement financé par des fonds de NIH IA 46969, et tous les milieux de culture cellulaire ont été produites par le Laboratoire central des médias, qui est financé par le NIH octroi CA 16672.
Materials
Solution and Buffers |
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Activation agents |
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Cytokine secretion inhibitors |
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Antibodies |
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References
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