Summary
Una tecnica è descritta per impiantare quattro
Abstract
Registrazione da nervi e muscoli chiave di
Protocol
1. Elettrodo Fabrication
- Per creare l'elettrodo, usare le forbici per tagliare un pezzo di smalto rivestite 0.001 pollici filo di acciaio inox del diametro di circa 2 metri di lunghezza. Allegare una pallina di gomma pane a ciascuna estremità del filo, piegare il filo a metà, e far girare le estremità per creare un doppino, chiamato elettrodo differenziale.
- Nastro entrambe le estremità del filo per evitare svelare. Fare quattro elettrodi differenziale, utilizzando un nastro di colore diverso per ogni elettrodo differenziale a scopo di identificazione (Figura 1A).
- Twist due elettrodi differenziale insieme, lasciando due centimetri non torti da una parte e 1 pollice su l'altra estremità. Ripetere con la coppia di elettrodi rimanenti differenziale (Figura 1B).
- Twist entrambe le serie di due elettrodi differenziale insieme, facendo in modo che le estremità rimangono torti. Tenere il gruppo elettrodi in silicone e applicare la colla casa all'incrocio dei quattro elettrodi differenziale, lasciando l'estremità libere. Hang e consentire la colla per asciugare per almeno 4 ore (Figura 1C).
- Per isolare i rami, giaceva il gruppo elettrodi su un piatto, mobile, tale superficie un pezzo di legno. Si aprono a ventaglio le estremità e fissarli con nastro adesivo. Utilizzare un piccolo pezzo di plastica per elevare il gruppo elettrodi appena prima che i rami, e sicuro che con il nastro.
- In un microscopio da dissezione, utilizzare pinze per rivestire i rami con la colla al silicone. Le estremità lunga da 1 pollice sarà dentro l'animale, per cui dovrebbero avere uno strato molto sottile di colla. Lasciare asciugare la colla per almeno 3 ore.
- Accorciare la 1-pollice lungo termine di un elettrodo differenziale a due centimetri. Su ogni filo, togliere 1 cm di silicone e smalto. Curl un filo nudo in un gancio per la registrazione. Piegare l'altro filo in alto e lontano dal gancio, questo servirà come il filo di terra. Ripetere l'operazione per i rimanenti tre elettrodi.
- Selezionare uno dei quattro elettrodi sul fine da 2 pollici. Usare pinze per raschiare silicone e smalto fuori, esponendo 1 cm di nudo filo di acciaio inossidabile su ciascuno dei 2 fili. Saldare un connettore d'oro a ciascuno dei due fili. Usare un pezzo di nastro di laboratorio per assicurare la fine e di mantenere una separazione tra il suolo ed i perni di registrazione. Ripetere l'operazione per i rimanenti tre elettrodi.
- Collegare un 1-2cm sfera della colla di silicone al cavo, a circa 1,5 cm dalla fine gancio per fissare gli elettrodi dentro l'animale. Lasciare asciugare per almeno un'ora (Figura 1D).
Figura 1. Dell'Assemblea Fabrication elettrodi. (A) elettrodo differenziale singola costituita da un filo piegato e intrecciato con la sua estremità fissato con nastro adesivo. (B) Due elettrodi differenziale intrecciati insieme, lasciando spazio torti alle estremità. Diverse nastro colorato o un altro contrassegno deve essere utilizzato per identificare le estremità. (C) Tutti gli elettrodi differenziale quattro combinati in un singolo gruppo elettrodi formando un unico cavo, con sedi distaccate degli elettrodi individuali su ciascuna estremità, indicati con colori diversi di nastro. (D) forma finale del gruppo elettrodi. Sulla sinistra, ci sono arricciate ganci per le registrazioni e fili di terra per ogni elettrodo differenziale. Sulla destra, pin del connettore d'oro sono stati saldati i fili per la connessione all'amplificatore. Una palla di ancoraggio del silicone colla è stato anche collocato verso il lato sinistro del gruppo.
2. Preparazione di animali per l'impianto
- Selezionare un animale sano che pesa circa 350-450g. In risposta a piccoli pezzi di alghe, l'animale deve generare morsi ad intervalli da 3 a 5 secondi. L'intervento completo di impianto di elettrodi dovrebbe durare circa un'ora.
- Per anestetizzare l'animale, si iniettano con il 30% w / v isotonica MgCl 2. Per evitare la perdita di emolinfa e MgCl 2, il sito di iniezione possono essere rivestiti in supercolla prima di rimuovere l'ago.
Figura 2. Schema che mostra come l'animale è appuntata per l'impianto di elettrodi, e la posizione della ferita (indicato da una barra). - Lay anestetizzato l'animale in un vassoio dissezione con il suo piede. Di fronte alla testa di animale in poi, spostare l'area di branchie alla vostra sinistra tale che l'animale è parzialmente su un fianco, appoggiato distanza. Definire con precisione i tentacoli anteriori (Figura 2).
- Collocare il vassoio sul palco di un microscopio da dissezione. Sostenere il vassoio in un angolo di circa 20 gradi di elevare la testa e raccogliere il emolinfa nella coda, lontano dalla incisione.
- Dissezione con forbici, avviare una incisione leggermente a destra del eyespot ed estenderlo da 1 a 1,5 centimetri anteriormente. Usa divaricatori attaccato ai bordi del vassoio per tenere aperta l'incisione (Figura 2; bar vicino nota incisione eyespot indicazione).
- Per esporre la massa buccale, utilizzare pinze per sollevare la membrana trasparente sottola pelle e usare le forbici per tagliare un'apertura corrispondente l'incisione principale. Rimboccare i bordi della membrana in divaricatori.
3. L'impianto di elettrodi
- Posizionare il gruppo elettrodi su un micromanipolatore e spostarlo sopra incisione dell'animale.
- Il nervo radular è più difficile da accedere, e dovrebbe essere affrontata prima. Ci sono due opzioni per l'accesso al nervo radular.
- La prima opzione, che è preferibile, è di guardare sotto il ganglio buccale tra BN1 e BN2. Se un ramo del nervo radular è visibile, utilizzare punta fine pinze piegato in un gancio per sollevare il ramo (Figura 3, ciclo di RN sotto ganglio etichettati 1).
- Se un ramo del nervo radular non è accessibile al di sopra del muscolo, una seconda opzione è quella di accedervi tramite una piccola incisione in I2 accanto al tessuto connettivo alla base del ganglio vestibolare (Figura 3, RN sotto muscolare etichettati 2). L'incisione in I2 deve passare attraverso due strati del muscolo I2. Tenere su il bordo del muscolo incisione con una pinza dritta e usare il forcipe agganciato per tirare fuori un ramoscello di RN.
- Tenendo premuto il nervo con le pinze agganciato, utilizzare un diverso set di pinze per manipolare il gancio elettrodo sul nervo.
- Utilizzare il micromanipolatore per sollevare il gancio in modo che il nervo viene innalzato dalla massa buccale chiara e precisa dei nervi o altri tessuti. Non estendere il nervo.
- Asciugare l'elettrodo con un Kim-Wipe o aspirazione fuori il liquido in eccesso con una siringa. Tensione dell'acqua può causare il coraggio di crollare su se stesso, o un sigillo d'acqua per formare sotto il nervo. In entrambi i casi, l'area deve essere completamente asciutta prima di colla è applicata.
- Applicare una goccia di colla dove la base del gancio è in contatto con la parte inferiore del nervo. Applicare una goccia di soluzione fisiologica o Aplysia emolinfa per impostare la supercolla. Quando la colla è niente di bagnato dovrebbe essere spostato come ottenere collante tra il filo ed il nervo avrebbe bloccato il collegamento elettrico.
- Secco il gancio di nuovo. Mix Kwik-Sil colla su un impacco di ghiaccio.
- Usare la punta di uno spillo di applicare una piccola quantità di Kwik-Sil colla, ricoprendo completamente qualsiasi filo esposto del gancio, ma non il filo di terra.
- Lasciare che la colla da impostare per circa 5 minuti, riaggiustare la colla se si tira fuori dalle sezioni del gancio. La colla è impostato quando si attacca più al tatto con il perno (Figura 4 mostra la configurazione finale).
- Una volta che l'elettrodo nervo radular è impostato, il muscolo I2 è possibile accedere. Nella zona tra BN1 e BN2, usare il forcipe agganciati al gancio e per separare due fasce del muscolo I2 dal resto del muscolo tirando delicatamente le bande verso l'alto. Collegare l'elettrodo con la stessa procedura.
- Nervi buccale 2 e 3 sono facilmente accessibili e gli elettrodi sono collegati con la stessa procedura.
- Una volta che tutti gli elettrodi sono collegati, far scorrere il gruppo elettrodi in l'animale fino alla ancoraggio silicone.
- Sutura l'incisione chiuso intorno al cavo elettrodo sporgente, mantenendo l'ancora dentro l'animale. Supercolla i punti per garantire una buona tenuta.
- Inserire le punte d'oro connettore all'altra estremità dell'elettrodo in un piccolo blocco di polistirolo. Rispedire l'animale verso il serbatoio principale in un contenitore aerato isolamento per il pernottamento di recupero.
Figura 3. Uno schema dell'apparato di alimentazione Aplysia conosciuta come la massa buccale. Vengono mostrati i nervi buccale (BN1, BN2, BN3), il nervo radular (RN) che esce dal fondo del ganglio buccale, poi si tuffa sotto il muscolo, e la posizione sul muscolo I2 cui è collegato l'elettrodo.
Figura 4. Schema di singolo elettrodo collegato ad un nervo (o muscolare) e incollate in posizione. Si noti che il de-isolata regione del gancio arricciata è in contatto diretto con il nervo (o muscolare), ancorata in posizione con colla, e isolati elettricamente dal mezzo liquido con Kwik-Sil. Si noti inoltre che la punta deinsulated dell'elettrodo di massa è esposto al mezzo fluido.
4. Registrazione
- Acclimatare l'animale in un contenitore aerato, mentre collegato l'apparecchio di controllo per almeno 1,5 ore. Monitorare il segnale, mentre l'animale è acclimatando per verificare che tutti gli elettrodi sono di lavoro e che i livelli di rumore sono bassi.
- Utilizzare una videocamera per registrare il comportamento alimentare durante l'uso del computer per registrare i segnali dagli elettrodi neurali e muscolari. Sincronizzare i video e le registrazioni degli elettrodi utilizzando un segnale onda quadra che controlla un contatore digitale in vista della telecamera mentre si è contemporaneamente registrato come un canale aggiuntivo sul computer in Axoscope.
- Alimentazione comportamenti sono suscitato dalle tecniche dedescritto nel Morton e Chiel 1993.
Anche se gli animali invertebrati non richiedono l'approvazione formale da parte di un uso animale e del comitato istituzionale di cura, ci siamo assicurati che tutti i trattamenti di Aplysia minimizzare i danni e sofferenze agli animali, e che tutte le tecniche chirurgiche sono fatto mentre l'animale è completamente anestetizzato.
Rappresentante Risultati
Figura 5. (A) le registrazioni simultanee a quattro canali da un muscolo (il muscolo goniometro I2), e da tre nervi buccale (il nervo radular, RN, nervo buccale 2, BN2, e del nervo vestibolare 3, BN3) durante una risposta deglutizione. (B) Un fermo immagine dal video registrazione simultanea degli animali liberamente comportarsi come ingoia una striscia di alga pretagliate (0,5 cm di larghezza), che è stato segnato a intervalli di 0,5 cm con fasce bianche in modo che i suoi movimenti possono essere facilmente visualizzati come Si nutre.
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Discussion
Una innovazione fondamentale che ha fatto queste registrazioni di successo sta combinando gli elettrodi in un unico cavo. Due registrazioni elettrodi sono stati usati in precedenza, ma l'espansione a quattro elettrodi individuali ha portato alla formazione di aderenze chirurgiche che spesso impedito all'animale di fare movimenti di alimentazione normale. Combinando gli elettrodi in un cavo di ridurre la maggior parte degli elettrodi dentro l'animale, che a sua volta riduce la risposta immunitaria e permette all'animale di muoversi più liberamente.
L'altro aspetto innovativo di questa procedura è la combinazione di supercolla e Kwik-Sil per collegare gli elettrodi al nervose o muscolari. In precedenza, solo supercolla era stato usato, ma la combinazione delle due colle opere più affidabile e può durare diversi giorni più di Colla, che scompone in circa 3 giorni in presenza di acqua.
Abbiamo dimostrato che è possibile impiantare elettrodi extracellulari in intatti, gli animali si comportano per la registrazione o la stimolazione da i corpi cellulari dei neuroni individuali identificate [Warman e Chiel, 1995;. Lu et al, 2008]. La tecnica di elettrodi multipli che abbiamo descritto in questo documento potrebbe quindi essere utilizzata per registrare simultaneamente da e manipolare l'attività di quattro neuroni diversi identificato, o una combinazione di neuroni, muscoli e nervi.
Abbiamo utilizzato la tecnica con quattro elettrodi, ma è probabile che avrebbe funzionato per diversi elettrodi aggiuntivi. Inoltre, in un esperimento inedito, questi elettrodi sono stati utilizzati per registrare dal nervo pudental del ratto, che indica che gli aspetti di questa tecnica potrebbe essere utile negli animali vertebrati e negli esseri umani.
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Acknowledgments
Noi riconosciamo con gratitudine il sostegno del NIH (NS047073 a HJC). Anche noi siamo grati a Caterina Kehl per lei i primi esperimenti con Kwik-Sil, che ci ha incoraggiato ad usarlo per la nostra applicazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire Company | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE Healthcare | ||
| Kwik-Sil Adhesive | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Duro Qwik-Gel superglue | Henkel Corp | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:100-1000Hz nerves,10-1000Hz I2 muscle | |
| Axoscope 10.1 | Molecular Devices | ||
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 |
References
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Ye, H., Morton, D. W., Chiel, H. J., J, H. nbsp;Neuromechanics of multifunctionality during rejection in Aplysia californica. J. Neurosci. 26, 10743-10755 (2006).
