Summary
Este protocolo de vídeo ilustra el aislamiento y cultivo de las células endoteliales de vena umbilical (HUVEC) de cordón umbilical humano. Una vez aisladas estas células se pueden utilizar en los ensayos de la angiogénesis in vitro, como el gel de fibrina Optimizado ensayo de bolas también se demuestra por el laboratorio de Hughes.
Abstract
La angiogénesis es un complejo proceso de múltiples pasos, donde en respuesta a estímulos angiogénicos, nuevos vasos son creados a partir de los vasos existentes. Estas medidas incluyen: la degradación de la membrana basal, proliferación y migración (brotes) de las células endoteliales (CE) en la matriz extracelular, la alineación de la CE en los cables, la formación del lumen, anastomosis y la formación de una nueva membrana basal. Muchos de los ensayos in vitro se han desarrollado para estudiar este proceso, pero la mayoría sólo imitar ciertas etapas de la angiogénesis, y morfológicamente los vasos a menudo no se parecen a los barcos en vivo. Aquí se demuestra una optimización en el ensayo de angiogénesis in vitro que utiliza la vena umbilical humana CE y los fibroblastos. Este modelo recapitula todas las etapas clave al comienzo de la angiogénesis, y sobre los vasos pantalla lúmenes patente intercelular rodeado de polarización CE. Los buques pueden ser fácilmente observados por contraste de fases y microscopía lapso de tiempo, y se recuperó en forma pura para aplicaciones posteriores.
Protocol
Procedimiento
- Coloque el cable en la almohadilla limpia y aplique de exceso de sangre. Haga cortes frescos en ambos extremos del cable.
- Introduzca 21 1 / 2 G aguja con el capuchón de la aguja de plástico, en la vena. (La vena es la apertura más grande, los 2 más pequeñas son las arterias)
- Abrazadera de la aguja en su lugar con una pinza hemostática y acoplar la jeringa de 20 cc de Hanks a la aguja.
- Empuje el Hanks a través de la vena con una presión moderada. Recoger los residuos en el vaso con cloro. (Sosteniendo la aguja y la cuerda con una mano mientras empuja sería evitar que la aguja de salir de la vena.) Si hay una gran cantidad de sangre en la vena, lavar por segunda vez.
- Coloque el cable en el teclado y la abrazadera el otro extremo de la vena. Rellenar con unos pocos mL de Hanks para comprobar si hay fugas a lo largo de la cuerda. Retire los 5 ml y desconectar la abrazadera inferior.
- Desconecte la jeringa de 20 cc. Retire el émbolo de la jeringa de 10cc. Conecte la jeringa de 10cc con aguja, se vierte en 10 ml de colagenasa y sustituir el émbolo. Impulsar la colagenasa en la vena hasta que vea la primera cantidad de salida del extremo abierto. Vuelva a sujetar el extremo abierto y se llenan de colagenasa hasta que haya distensión moderada de la vena. Demasiada distensión en la contaminación del músculo liso.
- Masaje suavemente el cable.
- Incubar cable (con pinzas hemostáticas, aguja y jeringa conectada) en DPBS a 37 ° C durante 15 min.
- Mientras se incuba, siguen los pasos 1-8 con cable de 2 ª.
- Después de la incubación, tomar el cable de vaso y mientras se mantiene el cable en el tubo de 50 ml cortar el extremo por encima de la abrazadera inferior. Asegúrese de recoger todo lo que en el tubo. Empuje la colagenasa restantes a través del cordón, a continuación, conecte la jeringa de 20 cc y empujar a través de Hanks con una presión moderada.
- Si no hay células del músculo liso son necesarios, deseche el cable en este momento. De lo contrario, el cable del mismo en un segundo tubo de 50 ml con 5 ml de colagenasa ~ e incubar a 37 ° C durante 30-60 min.
- Mantenga el tubo hasta que todos los cables se hacen.
- Girar los tubos a ~ 1200 rpm durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante (a excepción de ~ 1.2 ml). Resuspender el precipitado en 5ml PHEC + y la placa en un T25.
- Se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2 durante la noche.
- Día siguiente se retira el sobrenadante y vuelva a colocar con medio fresco. Si hay muchos glóbulos rojos, lavar una vez con M199, a continuación, agregar + PHEC. Continuar la incubación de la forma habitual hasta que la placa es confluente (1-4 días). Dividido en un gelatinizada T75.
- Una vez que T75 es confluente, se dividió en tres T75s. Congelar dos viales por frasco.
Nota: Las células endoteliales (activado) tienen un aspecto de adoquín. Las células endoteliales son activadas a veces (larga y puntiaguda) a la derecha después de su aislamiento, después de un par de pases que por lo general regresan a un estado unactive.
Limpieza
- Con mucho cuidado, deshacerse de las agujas en el contenedor de objetos punzantes.
- Deseche las jeringas en un recipiente grande de riesgo biológico.
- Ponga todos los tejidos en la bolsa de riesgo biológico pequeños. Cierre la bolsa y se congelan a -20 º C hasta que la incineración.
- Ponga todos los instrumentos en virucida por lo menos 10 min.
- Añadir medio de incubación de los residuos / lejía vaso. Deje reposar por lo menos 10 min.
- Deseche las pastillas de banco en los residuos de riesgo biológico.
- Rocíe el interior y exterior de los vasos, mesa de trabajo y la tapa del baño de agua con vircide. Deje reposar 10 minutos y luego limpie.
- Enjuague los vasos y los instrumentos con agua tibia y pasar sobre una rejilla para secar (blot de los instrumentos para que no se oxidan).
- Deshágase de los desechos descontaminados por el fregadero.
- Volver medios no utilizados a la nevera.
- Deseche los guantes de residuos biopeligrosos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Collagenase | 10 mL per cord, warmed to 37 °C | ||
| Tissue culture flasks | T75, one per cord. | ||
| Hanks medium | |||
| scissors | sterile | ||
| beaker | sterile | ||
| 50 mL tubes |
