Summary
Este protocolo de vídeo ilustra o isolamento e cultura de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) de cordão umbilical humano. Uma vez isolados essas células podem ser usadas em ensaios de angiogênese in vitro como o Gel de fibrina Optimized Bead Assay também demonstrada pelo laboratório Hughes.
Abstract
A angiogênese é um processo de várias etapas complexas, onde, em resposta a estímulos angiogênicos, novos vasos são criados a partir da vasculatura existente. Estes passos incluem: degradação da membrana basal a proliferação e migração (sprouting) das células endoteliais (CE) na matriz extracelular, o alinhamento da CE em cordas, formação de lúmen, a anastomose, e formação de uma nova membrana basal. Muitos ensaios in vitro têm sido desenvolvidos para estudar este processo, mas a maioria apenas imitar determinadas fases da angiogênese, e morfologicamente os vasos muitas vezes não se assemelham a vasos in vivo. Aqui demonstramos um otimizado ensaio in vitro que utiliza a angiogênese umbilical humano veia CE e fibroblastos. Este modelo recapitula todas as etapas chave no início da angiogênese, e mais importante dos vasos mostrar lumens patente intercelular cercado por CE polarizada. Vasos podem ser facilmente observados por contraste de fase e microscopia de lapso de tempo, e recuperados em forma pura para aplicações a jusante.
Protocol
Procedimento
- Lay cabo na almofada limpa e dab off excesso de sangue. Fazer cortes frescos em ambas as extremidades do cabo.
- Inserir 21 1 / 2 G agulha com a bainha da agulha de plástico ON, na veia. (A veia é a maior abertura; os 2 menores são artérias)
- Fixar a agulha no lugar com uma pinça hemostática e anexar a seringa 20cc de Hanks para a agulha.
- Empurre a Hanks através da veia com pressão moderada. Recolher os resíduos no recipiente com água sanitária. (Segurando a agulha e cordão com uma mão enquanto empurrando impediria a agulha pulando para fora da veia.) Se há um monte de sangue na veia, lave pela segunda vez.
- Lay cabo na almofada e prenda a outra extremidade da veia. Preencher com alguns ml de Hanks para verificar vazamentos ao longo da medula. Retirar a 5 mL e desconecte o grampo inferior.
- Desconectar a seringa de 20cc. Retire o êmbolo da seringa 10cc. Anexar seringa 10cc a agulha, despeje 10ml colagenase e substituir êmbolo. Empurre colagenase na veia até ver o primeiro montante sair da extremidade aberta. Re-fixação da extremidade aberta e encha com colagenase até que haja distensão moderada da veia. Demais resultados distensão na contaminação do músculo liso.
- Massagem suavemente o cabo.
- Cabo de incubar (com hemostats agulha e seringa em anexo) em DPBS a 37 ° C por 15 min.
- Durante a incubação, continue os passos 1-8 com 2 nd cabo.
- Após a incubação, tomar cabo de fora do copo e, segurando o cabo de cima do tubo de 50 mL corte a extremidade acima do grampo inferior. Certifique-se de coletar tudo no tubo. Empurre a colagenase restantes através do cordão, em seguida, anexar a seringa 20cc e empurre Hanks completamente com pressão moderada.
- Se não houver células musculares lisas são necessários, descartar o cabo neste momento. Caso contrário, o cabo do mesmo em um tubo de 50 mL em segundo lugar com 5ml ~ colagenase e incubar a 37 ° C por 30-60 min.
- Manter o tubo até que todos os cabos são feitos.
- Girar tubos em ~ 1200 rpm por 5 min.
- Aspirar o sobrenadante (exceto para ~ mL 1-2). Ressuspender o sedimento em 5mls PHEC + e placa em um T25.
- Incubar a 37 ° C com 5% de CO 2 durante a noite.
- No dia seguinte remova o sobrenadante e substituir com a mídia fresco. Se houver muitas hemácias, lave uma vez com M199, em seguida, adicione + PHEC. Continue incubação, como de costume até que a placa é confluente (1-4 dias). Dividida em uma T75 gelatinizado.
- Uma vez T75 é confluente, dividida em três T75s. Congelar dois frascos por frasco.
Nota: As células endoteliais (unactivated) têm uma aparência de paralelepípedo. Células endoteliais são ativados por vezes (longo e pontudo), logo após o isolamento, depois de alguns passes que eles geralmente voltam para um estado unactive.
Limpeza
- Com muito cuidado, descarte de agulhas em recipiente adequado.
- Dispor de seringas em recipiente biohazard grande.
- Colocar todo o tecido em saco biohazard pequeno. Saco de fechar e congelar a -20 ° até a incineração.
- Mergulhe todos os instrumentos em virucide por pelo menos 10 min.
- Adicionar meio de incubação para resíduos copo / água sanitária. Deixe descansar por pelo menos 10 min.
- Descarte as pastilhas de bancada para resíduos de risco biológico.
- Spray para baixo o interior eo exterior de copos, bancada de trabalho e do banho de água com tampa vircide. Deixe descansar 10 min, em seguida, limpe.
- Enxágüe copos e instrumentos com água morna e pendurar na cremalheira para secar (blot fora os instrumentos para que eles não ferrugem).
- Descarte de resíduos descontaminados na pia.
- Retorno de mídia não utilizados para geladeira.
- Dispor de luvas em resíduos de risco biológico.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.1% Collagenase | 10 mL per cord, warmed to 37 °C | ||
Tissue culture flasks | T75, one per cord. | ||
Hanks medium | |||
scissors | sterile | ||
beaker | sterile | ||
50 mL tubes |