Summary
संयंत्र बायोमास एक प्रमुख कार्बन न्यूट्रल अक्षय संसाधन है कि जैव ईंधन के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बायोमास संयंत्र सेल दीवारों, एक structurally जटिल समग्र सामग्री lignocellulosics करार दिया के मुख्य रूप से होते हैं. यहाँ हम दीवार व्युत्पन्न कार्बोहाइड्रेट की सामग्री और संरचना के एक व्यापक विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
अक्षय, कार्बन तटस्थ, और टिकाऊ उद्योग और समाज के लिए कच्चे माल के लिए की जरूरत है 21 वीं सदी के लिए सबसे अहम मुद्दों में से एक बन गया है. यह औद्योगिक कच्चे माल के रूप में संयंत्र के उत्पादों के परिवहन के लिए तरल ईंधन के उत्पादन के लिए उपयोग में रुचि फिर से उभार दिया है
Protocol
1. कोशिका दीवार अलगाव
- पीसने की मोटे तौर पर 60 70mg हवा या 2ml sarstedt पेंच टोपी एक retschmill (1 मिनट, 25 हर्ट्ज) का उपयोग कर ट्यूब में 5.5 मिमी स्टेनलेस स्टील गेंदों के साथ सूखे पौधे सामग्री फ्रीज. एक विकल्प, एक उच्च throughput पीस और रोबोट करार दिया iWall वितरण का उपयोग 3 I भाग में वर्णित है.
- कोशिका दीवार अलगाव प्रक्रिया के साथ जारी रखने से पहले इस्पात गेंदों को दूर
कोशिका दीवार सामग्री की तैयारी की विस्तृत प्रोटोकॉल 3 I भाग में दिखाया गया है. यहाँ प्रोटोकॉल लिखा कदम पूर्णता के लिए. - जलीय 70% इथेनॉल के 1.5 मिलीलीटर, और अच्छी तरह भंवर जोड़ने
- 10 गोली न्यूनतम शराब अघुलनशील अवशेषों के लिए 10,000 rpm पर अपकेंद्रित्र
- aspirate या छानना सतह पर तैरनेवाला
- / क्लोरोफॉर्म मेथनॉल (01:01 v / v) के अवशेषों का हल 1.5 मिलीलीटर जोड़ने और ट्यूब अच्छी तरह हिला गोली resuspend
- 10 मिनट के लिए 10,000 rpm पर अपकेंद्रित्र और aspirate या छानना सतह पर तैरनेवाला
- एसीटोन के 500 उल में resuspend गोली
- हवा की एक धारा के साथ विलायक 35 डिग्री सी सूखी जब तक लुप्त हो जाना
यदि जरूरत सूखे नमूने प्रसंस्करण आगे तक कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है है. - नमूना फिर से निलंबित एक 0.1 एम sodiumacetate बफर पीएच 5.0 की 1.5 मिलीलीटर में गोली से स्टार्च को हटाने आरंभ करने के लिए.
- 20 मिनट के लिए sarstedt ट्यूबों और गर्मी टोपी. 80 डिग्री सेल्सियस हीटिंग ब्लॉक में.
- बर्फ पर निलंबन शांत
- गोली के लिए निम्नलिखित एजेंट जोड़ें: 0.01% Sodiumazide के 35 μl (3 NaN), 35 μl (50 μg/1mL एच 2 हे, बेसिलस प्रजातियों से, सिग्मा); amylase सिग्मा 17 μl Pullulanase (दण्डाणु acidopullulyticus से 18.7 इकाइयों;) . ट्यूब और अच्छी तरह भंवर कैप.
- निलंबन रात से अधिक 37 incubated ° सी प्रकार के बरतन में. Orienting ट्यूब क्षैतिज सहयोगियों मिश्रण में सुधार.
- 100 पर गर्मी निलंबन ° C पाचन को समाप्त करने के लिए एक हीटिंग ब्लॉक में 10 मिनट के लिए.
- (10,000 rpm, 10 मिनट) अपकेंद्रित्र त्यागें और सतह पर तैरनेवाला युक्त solubilized स्टार्च
- 1.5 मिलीलीटर पानी जोड़ने, vortexing, centriguation, और धोने के पानी के decanting शेष गोली तीन बार धो लो.
- एसीटोन के 500 उल में resuspend गोली
- 35 पर हवा की एक धारा ° सी के साथ शुष्क जब तक विलायक लुप्त हो जाना. बेहतर सुखाने के लिए एक रंग के साथ सामग्री को तोड़ने ट्यूब में यह आवश्यक भी हो सकता है.
सूखे सामग्री पृथक सेल दीवार (lignocellulosics) प्रस्तुत करता है. यदि जरूरत सूखे नमूने प्रसंस्करण आगे तक कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है है.
2. मैट्रिक्स polysaccharide रचना
इस विधि 1 Albersheim द्वारा प्रकाशित विधि का अनिवार्य रूप से एक संशोधन है.
- दीवार सामग्री के monosaccharide संरचना निर्धारित करने के लिए सेल 2ml starstedt ट्यूबों में या तो हाथ से या एक highthroughput iWall, एक रोबोट रोबोट पीसने और वजन का उपयोग फैशन में दीवार सामग्री के 2 मिलीग्राम वजन.
- एक आंतरिक मानक के रूप में एक Inositol समाधान (5mg/ml) के 20 उल जोड़ें. 2 मिलीग्राम कोशिका दीवार नमूना के लिए हम 100 स्नातकीय जोड़ने की सलाह देते हैं.
- एसीटोन के 250 उल साथ ट्यूब दीवारों कुल्ला करने के लिए ट्यूब के तल पर कोशिका दीवार सामग्री इकट्ठा करने के लिए, और एसीटोन airflow के तहत बहुत कोमल लुप्त हो जाना.
- कमजोर एसिड hydrolysis के लिए प्रत्येक नमूना के लिए 2M trifluoroacetic एसिड (TFA) के 250 उल जोड़ें. TFA ध्यान से जोड़ें करने के लिए सुनिश्चित करें के लिए कोई सामग्री ट्यूब दीवारों पर छिड़क है.
- कसकर टोपी और 121 पर 90 मिनट के लिए सेते ° सी में एक हीटिंग ब्लॉक.
- हीटिंग और ब्लॉक नमूने बर्फ पर शांत.
- 10 मिनट के लिए 10,000 rpm पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र.
- अम्लीय सतह पर तैरनेवाला युक्त मैट्रिक्स एक गिलास पेंच टोपी शीशियों गोली सामग्री को परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित बनाने के लिए monosaccharide व्युत्पन्न polysaccharide के 100 उल हस्तांतरण. गोली क्रिस्टलीय सेलूलोज़ नीचे परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (3 देखें.)
- एक वाष्पीकरण डिवाइस में एक हवा की कोमल धारा के तहत ग्लास ट्यूब में TFA लुप्त हो जाना.
- 300 μl 2-propanol, भंवर जोड़ सकते हैं और 25 में लुप्त हो जाना डिग्री सेल्सियस (तीन बार के एक कुल के लिए दोहराने)
- alditol एसीटेट derivatization प्रक्रिया के पहले कदम के लिए उनके इसी alditols monosaccharides के कमी का प्रदर्शन है. इस प्रयोजन के लिए एक सोडियम borohydride प्रत्येक सूखे नमूने के समाधान के 200 μl जोड़ें. एक ताजा समाधान प्रत्येक 1M अमोनियम हीड्राकसीड के 1ml प्रति सोडियम borohydride के 10mg का उपयोग कर समय तैयार है.
- कमरे के तापमान पर 1.5 घंटे के लिए गिलास शीशी को छोड़
- हिमनदों एसिटिक एसिड के 150 उल जोड़कर समाधान बेअसर
- भंवर और 25 में लुप्त हो जाना डिग्री सेल्सियस.
- 250 μl एसिटिक एसिड / मेथनॉल (01:09, v / v), भंवर जोड़ सकते हैं और 25 में लुप्त हो जाना ˚ सी
- 250 μl मेथनॉल को जोड़ने के लिए, और हवा की धारा के तहत लुप्त हो जाना (तीन बार के एक कुल के लिए दोहराएँ)
- Alditols के एसिटिलीकरण के लिए, एसिटिक एनहाइड्राइड के 50 μl और Pyrid के 50 μl जोड़ेंine भंवर, और 20 मिनट के लिए सेते 121 ° सी में एक हीटिंग ब्लॉक.
- ब्लॉक में बर्फ के साथ शांत नमूनों नीचे जबकि अस्थायी कमी के लिए लगभग कमरे के तापमान के लिए प्रतीक्षा.
- कमरे के तापमान पर हवा की कोमल धारा के तहत अभिकर्मकों लुप्त हो जाना. सावधान रहें: alditol एसीटेट अत्यधिक अस्थिर कर रहे हैं.
- 200 μl टोल्यूनि जोड़ने और हवा के तहत लुप्त हो जाना (x3)
- अंतिम चरणों में alditol एसीटेट निकाले जाते हैं. सबसे पहले, एथिल एसीटेट और हल्के ज़ुल्फ़ के 500 उल जोड़ें.
- पानी के 2 मिलीग्राम, टोपी ट्यूब और भंवर में जोड़ें.
- 5 मिनट के लिए 2,000 आरपीएम पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र स्पष्ट अलग परतों (शीर्ष पर एथिल एसीटेट, पानी के तल पर) प्राप्त
- विंदुक आवेषण के साथ जीसी / एमएस की शीशियों में एथिल एसीटेट परत के 50 उल.
- जीसी शीशी और टोपी एसीटोन के 100 उल जोड़कर जलमिश्रित. नमूना मात्रा और कमजोर पड़ने के संस्करणों के लिए जीसी / एमएस ओवरलोडिंग से बचने समायोजित किया जा सकता है अगर नमूना एकाग्रता बहुत अधिक है.
जीसी शीशी 4 डिग्री सेल्सियस, यदि विश्लेषण जीसी / एमएस तुरंत आगे नहीं करता है पर भंडारित किया जा सकता - नमूने एक जीसी है कि एक quadrupole एमएस के साथ सुसज्जित है में अंतःक्षिप्त रहे हैं, लेकिन एक लौ ionization डिटेक्टर भी उपयुक्त है. एक Supelco SP-2380 (30mm एक्स 0.25mm x 0.25 सुक्ष्ममापी फिल्म मोटाई) स्तंभ एक 4min विलायक देरी और 1.5ml/min का एक प्रवाह की दर के साथ प्रयोग किया जाता है. इंजेक्ट नमूने निम्न तापमान कार्यक्रम के अधीन हैं: 160 पर प्रारंभिक पकड़ ° सी, 2 मिनट के लिए एक 20 डिग्री सेल्सियस / मिनट 200 रैंप डिग्री सेल्सियस और 5 मिनट के लिए पकड़, एक 20 डिग्री सेल्सियस मिनट / 245 करने के लिए रैंप डिग्री सेल्सियस पकड़ और 12 मिनट, 270 के लिए स्पाइक ° सी और 160 ° 2.26 सी के प्रारंभिक तापमान को ठंडा करने से पहले 5 मिनट के लिए पकड़) Peaks जन प्रोफाइल और / या प्रतिधारण समय मानकों के द्वारा की पहचान कर रहे हैं.. Monosaccharides मानक पर curves आधारित मात्रा निर्धारित कर रहे हैं.
3. क्रिस्टलीय सेलूलोज़ सामग्री
इस पद्धति का अनिवार्य रूप से 8 Updegraf द्वारा वर्णित है. पृथक सेल दीवार सामग्री (1 देखें) या दीवार सामग्री है कि पहले से ही 2M TFA (2.8 देखें) या तो शेष गोली एसिड उपचार के बाद तुरंत (2.8 देखें) या एक TFA के साथ इलाज किया गया है: इस प्रक्रिया के लिए शुरू सामग्री की एक संख्या हैं गोली, कि 2-propanol और सूखे के साथ धोया गया है.
- Updegraff अभिकर्मक के पेंच छाया ग्लास ट्यूब एक मिलीलीटर (नाइट्रिक एसिड पानी, 08:01:02 v / v एसिटिक एसिड) में TFA गोली में जोड़ें.
- कैप ट्यूब कसकर, भंवर, गर्मी और एक हीटिंग ब्लॉक में 100 पर ° सी 30 मिनट के लिए. इस उपचार का एक परिणाम के के रूप में केवल क्रिस्टलीय सेलूलोज़ गोली में अघुलनशील रहता है.
- कमरे के तापमान या कूलर के लिए बर्फ पर ब्लॉक में कूल नमूने
- 15 मिनट के लिए 10,000 rpm पर अपकेंद्रित्र के नमूने
- सतह पर तैरनेवाला सुनिश्चित करना है कि गोली परेशान और गोली से कोई सामग्री है हटाया नहीं है त्यागें. इस प्रयोजन के लिए लगभग छोड़ दें. ट्यूब में 150 उल सतह पर तैरनेवाला की.
- पानी की 1.5 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, हिला, अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला त्यागने जैसा कि ऊपर किया
- प्रक्रिया 3 अतिरिक्त एसीटोन की 1.5 मिलीलीटर का उपयोग बार धोने दोहराने
- एयर सूखी गोली हवा के साथ बहुत धीरे से, या बेंच पर शुष्क रात भर
- गोली (क्रिस्टलीय सेलूलोज़) अब क्या एक Saeman hydrolysis कहा जाता है के द्वारा पूरी तरह से ग्लूकोज में hydrolyzed है. इस प्रयोजन के लिए sarstedt ट्यूब 175 μl 72% Sulfuric एसिड जोड़ने
- 30 मिनट, और एक और 15 मिनट के लिए भंवर सेते के लिए कमरे के तापमान पर सेते
- 825 μl पानी और भंवर जोड़ने
- 5 मिनट के लिए 10,000 rpm पर नमूने अपकेंद्रित्र. वहाँ कुछ भूरे रंग सामग्री अघुलनशील, lignin, ट्यूब में शेष हो सकता है.
- ग्लूकोज सामग्री की सतह पर तैरनेवाला वर्णमिति anthrone परख का उपयोग assayed है. इस परख एक 96 अच्छी तरह से polystyrene microtiter प्लेट में किया जाता है.
- के लिए मानक वक्र एक 1mg/ml ग्लूकोज शेयर (0 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) का उपयोग करें और 0, 2, 4, 6, 8, और 10 उल pipetting 0, 2, 4, 6, 8, और 10 स्नातकीय मानकों डुप्लिकेट बनाने अलग उपयुक्त अच्छी तरह से में. पानी के साथ एक अच्छी तरह से ऊपर 100 उल भरें.
- अलग कक्षों में लेकिन मानक के रूप में एक ही microtiter प्लेट पर प्रत्येक नमूना सतह पर तैरनेवाला के 10 μl और पानी की 90 मिलीलीटर जोड़ें.
- हौसले से तैयार Anthrone अभिकर्मक (Anthrone केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड, 2 मिलीग्राम anthrone / एमएल सल्फ्यूरिक एसिड में भंग) की 200 μl जोड़ने
- 80 पर 30 मिनट के लिए गर्मी की थाली ° C एक ओवन में (एल्यूमीनियम गर्मी स्प्रेडर). ग्लूकोज युक्त नमूने पीले नीले, हरे में से बारी.
- थाली कमरे के तापमान के लिए ठंडा और अच्छी तरह हिला.
- 625 मिमी पर एक microtiter प्लेट रीडर का उपयोग कर प्लेट के अवशोषण को पढें.
- ग्लूकोज (और इसलिए क्रिस्टलीय सेलूलोज़ सामग्री) absorbance पर आधारित मानक एक ही थाली पर स्थापित वक्र की तुलना में गणना की है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 2 में एक दीवार के विश्लेषण का एक उदाहरण प्रस्तुत किया है. इस मामले में चिनार स्टेम (लकड़ी) प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लिखित विभिन्न प्रक्रियाओं द्वारा विश्लेषण किया गया था. मैट्रिक्स पुलिसlysaccharide रचना एक उदाहरण संयंत्र सेल दीवारों में ठेठ चीनी मौजूद पहचान chromatogram से प्रकाश डाला है, fucose, rhamnose, सिलोज़, arabinose, galactose, mannose और ग्लूकोज (और आंतरिक मानक inositol). चिनार के मुख्य hemicellulosic घटक xylan के रूप में उच्च सिलोज़ सामग्री द्वारा प्रदर्शन. हालांकि, इन शर्करा की बहुतायत फीडस्टॉक used4 के आधार पर अलग अलग होंगे. इस विश्लेषण में ग्लूकोज hemicellulose xyloglucan और अनाकार सेलूलोज़ से ली गई है. विश्लेषण के कारण डेटा mol% या स्नातकीय / मिलीग्राम दीवार सामग्री (या सूखी वजन) के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है. क्रिस्टलीय सेलूलोज़ सामग्री आत्म व्याख्यात्मक है, एक दीवार सूखी वजन के 20-50% के बीच के मूल्यों की उम्मीद कर सकते हैं. यहाँ और भाग I3 में प्रस्तुत परिणामों के आधार पर चिनार की लकड़ी का lignocellulosic रचना 21%, lignin, 30% hemicelluloses, और 41% की क्रिस्टलीय सेलूलोज़ है. शेष राख हो जाएगा.
चित्रा 1: lignocellulosic विश्लेषण के अवलोकन सेल दीवारों (lignocellulosics) कच्चे सूखे पौधे सामग्री से अलग कर रहे हैं. दीवार सामग्री तो aliquots में भारित है और विभिन्न assays के लिए subdivided. मैट्रिक्स polysaccharide रचना दीवार सामग्री एक कमजोर अम्ल (2M TFA) के साथ इलाज, उनके alditol एसीटेट के लिए जिसके परिणामस्वरूप solubilized monosaccharides derivatizing, और जीसी - एमएस द्वारा विश्लेषण के बाद की स्थापना की है. कमजोर एसिड उपचार के अवशेषों तथाकथित Updegraff अभिकर्मक केवल अघुलनशील crystlline सेलूलोज़ छोड़ने के पीछे के साथ धोया जाता है. सेलूलोज़ सल्फ्यूरिक एसिड से solubilized है और एक वर्णमिति ग्लूकोज की सामग्री का निर्धारण परख द्वारा मात्रा. समानांतर में, और lignin की सामग्री संरचना 3 I भाग में वर्णित के रूप में निर्धारित किया जा सकता है.
चित्रा 2: चिनार की लकड़ी के व्यापक lignocellulosic विश्लेषण चिनार (Populus tremoloides) से लकड़ी के चिप्स वर्णित प्रोटोकॉल के अधीन थे.
ऊपरी बाएँ: मैट्रिक्स polysaccharide संरचना, fuc fucose, RHA rhamnose, आरा arabinose, Xyl सिलोज़, मैन mannose, लड़की galactose, GLC ग्लूकोज, inositol आंतरिक मानक.
Discussion
वर्णित विधियों lignocellulosic बायोमास संयंत्र की रचना की एक तेजी से मात्रात्मक निर्धारण के सक्षम हैं. विधि मैट्रिक्स अर्थात् polysaccharides hemicelluloses चीनी संरचना, क्रिस्टलीय सेलूलोज़ सामग्री सहित ऐसी सामग्री की संरचना का निर्धारण की अनुमति देता है. प्रति व्यक्ति विभिन्न विश्लेषणात्मक तरीकों के throughput बदलता रहता है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का प्रयोग, मैट्रिक्स polysaccharide क्रिस्टलीय सेलूलोज़ सामग्री के लिए रचनाएं और 30 के लिए 20 नमूने संसाधित किया जा सकता है. डेटा इष्टतम फीडस्टॉक फसलों के मात्रात्मक प्रकृति के कारण, विविधता या जीनोटाइप जैव ईंधन के उत्पादन के लिए उनकी उपयुक्तता के मामले में मूल्यांकन किया जा सकता है.
Acknowledgments
हम उत्कृष्ट तकनीकी सेवा और जॉन, राल्फ मूल्यवान सलाह, चर्चा, और चिनार लकड़ी का नमूना के लिए विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय के लिए मैथ्यू रॉबर्ट Weatherhead के लिए आभारी हैं. इस काम रसायन विज्ञान, Geosciences और बायोसाइंसेज प्रभाग, मूल ऊर्जा विज्ञान, विज्ञान के कार्यालय, अमेरिका के ऊर्जा विभाग (पुरस्कार नं. डे-FG02-91ER20021) और अमेरिकी ऊर्जा विभाग (Doe) द्वारा ग्रेट झील के कार्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था Bioenergy अनुसंधान केंद्र (विज्ञान के डो BER कार्यालय डे - FC02 - 07ER64494).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| myo-Inositol | Sigma-Aldrich | I5125 | |
| Sodium Borohydride | Sigma-Aldrich | 213462 | |
| Pyridine | JT Baker | 3348-01 | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102 | |
| Spectromax Plus 384 | Molecular Devices | Plus384 | |
| GC-MS | Agilent Technologies | 7890A GC/5975C MSD | |
| 5.5mm Stainless Steel Balls | Salem Ball Company | (N/A) | |
| 96 well plate heat spreader | Biocision | Coolsink 96F | |
| Retsch Mill | Qiagen | TissueLyser II | |
| Heating block | Techne | Dri-block DB-3D | |
| Sample concentrator | Techne | FSC400D |
References
- Albersheim, P. A method for the analysis of sugars in plant cell wall polysaccharides by gas-liquid chromatography. Carbohydr. Res. 5, 340-340 (1967).
- Carroll, A., Somerville, C. Cellulosic Biofuels. Annu Rev Plant Biol. 60, 165-165 (2009).
- Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part I: Lignin. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).
- Somerville, C. Toward a systems approach to understanding plant-cell walls. Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).
- Teeri, T. T., Brumer, H. Discovery, characterisation and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endotransglycosylases. Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).
- UPDEGRAF, D. M. SEMIMICRO DETERMINATION OF CELLULOSE IN BIOLOGICAL MATERIALS. Anal. Biochem. 32 (3), 420-420 (1969).
