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Biology

के शोधन एम. magneticum तनाव Magnetosome एसोसिएटेड प्रोटीन MamAΔ41-1 AMB

Published: March 25, 2010 doi: 10.3791/1844
Automatic Translation
1, 1
1Department of Life Sciences and National Institute for Biotechnology in the Negev, Ben-Gurion University

Summary

माँ एक अनूठा Magnetosome जुड़े प्रोटीन जो magnetosome सक्रियण में शामिल होना दिखाया गया था. हम यहाँ से माँ विलोपन उत्परिवर्ती की शुद्धि प्रोटोकॉल (MamAΔ41) वर्तमान

Abstract

Magnetotactic बैक्टीरिया जलीय सूक्ष्मजीवों कि खुद geomagnetic क्षेत्रों के साथ मालूम करने में सक्षम हैं की एक विविध समूह शामिल हैं. इस व्यवहार के लिए उपयुक्त वातावरण के लिए अपने खोज सहायता माना जाता है

Protocol

1. और ई. में माँ जीन की क्लोनिंग और अभिव्यक्ति कोलाई

5'-GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG-3 'और 5'-GCGCGGCAGCCATA - TGGCATACG-3' उत्परिवर्ती जीन mamAΔ41 Magnetospirillum AMB-1 magneticum जीनोमिक डीएनए से पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का उपयोग करते हुए, प्राइमरों के साथ परिलक्षित किया गया था. प्रवर्धित डीएनए टुकड़े में, एक NcoI साइट दीक्षा codon ATG में पेश किया गया था और समाप्ति codon एक ScoI साइट के साथ बदल दिया गया था. टुकड़े NcoI और SacI के साथ पचा थे और pET52b (+) के संबंधित साइटों में क्लोन, pET52bMamAΔ41 - AMB1 को जन्म दे रही. इस निर्माण में, mamAΔ41 जीन फ्रेम में 10-सी टर्मिनस पर उनके टैग के साथ जुड़े हुए किया गया था. प्लाज्मिड ई. कोलाई तनाव BL21 में electroporated था. ई. कोलाई तनाव BL21 pET52bMamAΔ41 शरण ऑटो प्रेरण में हो गया था (15) 3 घंटे के लिए एम्पीसिलीन (50 मिलीग्राम / एमएल) 310 ° कश्मीर से युक्त मध्यम. खेती तो तापमान 310 ° से 300 ° कश्मीर में स्थानांतरित किया गया और 300 ° लालकृष्ण पर एक अतिरिक्त 48 घंटे के लिए बनाए रखा कोशिकाओं centrifugation द्वारा 5465g पर 277 में 10 मिनट ° के.एच. के लिए काटा गया 8 लीटर संस्कृति गीला सेल गोली के 60 ग्राम का उत्पादन किया.

2. बायोइनफॉरमैटिक्स गणना

आणविक वजन (मेगावाट) है, अमीनो एसिड अनुक्रम अनुसार और 280nm में प्रोटीन की 1mg/1ml की भविष्यवाणी अवशोषण की गणना, ProtParam सर्वर (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html) का उपयोग. 10His - टैग - MamAΔ41 के लिए मेगावाट दा 22529 (240 अमीनो एसिड) है और MamAΔ41 (नौ अमीनो एसिड के साथ उनकी टैग थ्रोम्बिन द्वारा हटाने के बाद छोड़ दिया) के लिए मेगावाट 20596.5Da (187 अमीनो एसिड) है. 280nm में 10His टैग - MamAΔ41 के लिए प्रोटीन की 1mg/1ml की भविष्यवाणी अवशोषण 0.595 और MamAΔ41 के लिए 0.579 है. इसके अलावा, अमीनो एसिड अनुक्रम में किसी भी सिस्टीन अवशेषों शामिल नहीं है. इसलिए, कम करने एजेंट के शुद्धिकरण की प्रक्रिया के दौरान आवश्यक नहीं हैं.

3. MamAΔ41 की शुद्धि

  1. शेयर समाधान तैयार करने के लिए, वजन और निम्न सांद्रता में तैयार (200 मिलीलीटर प्रत्येक): imidazole (मेगावाट 228.2 छ / mol) 4M समाधान, NaCl (मेगावाट 58.44 छ / mol) 5M समाधान, Tris - एचसीएल (मेगावाट 121.3 छ / mol ) 1M समाधान = 8 पीएच को समायोजित. दोहरा आसुत (DDW) पानी और मिश्रण का उपयोग एक भंवर जब तक समाधान स्पष्ट है जोड़ें. 0.22μm फिल्टर और कमरे के तापमान पर रखने के साथ फ़िल्टर समाधान.
  2. तैयार है और शेयर समाधान (Table1) में से 6 ताजा बफ़र्स फिल्टर.
  3. पतला और एक मात्रा 01:02 के अनुपात में, कक्षों की ग्राम बफर (एमएल) के बफर में निलंबित कोशिकाओं.
  4. DNase मैं (1 मिलीग्राम / एमएल) के जीवाणुओं की प्रत्येक 10gr लिए 10μl क्रम में नमूने में डीएनए टुकड़े को तोड़ने में जोड़ें. EDTA मुक्त protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल के बैक्टीरिया के प्रत्येक 20gr के लिए 1ml जोड़ें. बर्फ पर 20 मिनट के लिए सेते हैं.
  5. फ्रेंच प्रेस के चक्र के द्वारा 25,000 साई में दो कोशिकाओं खलल डाल दिया. Sonication के विपरीत, फ्रेंच प्रेस उच्च (> 10ml) की मात्रा सेल बाहर निकालना पर उच्च दबाव के तहत एक पतली छिद्र के माध्यम से कोशिकाओं को मजबूर द्वारा उद्देश्य है. पिस्टन इसके उपयोग और तापमान buildup के कारण विधानसभा से पहले दस मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा किया जाना चाहिए.
  6. स्थानांतरण 25ml ultracentrifuge एक ट्यूब में lysed कोशिकाओं और उन्हें ठीक संतुलन (50mg) एक बफर के साथ जब तक नमूना ट्यूब गर्दन लाइन तक पहुँचता है.
  7. 277 में 1 घंटे के लिए 270.000 ग्राम में अल्ट्रा centrifugation द्वारा अलग सेल मलबे ° के.एच.
  8. एक घर गुरुत्वाकर्षण नी NTA स्तंभ (2.5cm व्यास) स्तंभ पर नी NTA राल, जो 20% इथेनॉल में बरकरार रखता है के 4 मिलीलीटर जोड़कर तैयार करें. पूरी तरह से तरल पदार्थ ड्रॉप चलो, तो DDW के 40 मिलीलीटर के साथ धोने और द्रव ड्रॉप पूरी तरह से चलो. पूर्व equilibrated बफर ए के 40 मिलीलीटर के साथ स्तंभ में राल
  9. गुरुत्वाकर्षण नी NTA स्तंभ पर अल्ट्रा centrifugation ट्यूब से घुलनशील अंश लागू करें. ड्रॉप तरल पदार्थ, - प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा (अनबाउंड प्रोटीन) और 277K पर संरक्षित.
  10. अल्ट्रा centrifugation ट्यूब से एक छोटी सी टिप का उपयोग करने के लिए गोली स्क्रैप द्वारा गोली नमूना ले लीजिए. 50μl 5% 2X में β-mercaptoethanol एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर में टिप मिक्स.
  11. 100 मिलीलीटर बफर बी के साथ स्तंभ धो द्रव ड्रॉप चलो प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा करने और 277K पर संरक्षित.
  12. 15 चिह्नित Eppendorf ट्यूब (1.5ml) तैयार करें.
  13. Elution - स्तंभ करीब वाल्व और तब स्तंभ पर बफर सी के 1ml लोड, 3 वाल्व खोलने और प्रवाह के माध्यम से संग्रह द्वारा पीछा किया मिनट के लिए सेते हैं. इस कदम को तीन बार दोहराएँ.
  14. निलंबन की Elute बाकी 1 मिलीलीटर बफर सी वेतन वृद्धि पर और वाल्व बंद.
  15. आयुध डिपो में 280nm भिन्न उपाय और प्रोटीन चोटी के स्थान का मूल्यांकन, अगर आयुध डिपो अभी भी> 0.3, अतिरिक्त नमूने की जरूरत है.
  16. एसडीएस पृष्ठ एकत्र भिन्न का विश्लेषण. इस तरह के विश्लेषण के लिए निम्न नमूनों को के साथ भी किया जाना है, प्रवाह के माध्यम से अनबाउंड प्रोटीन, के माध्यम से प्रवाह धोने और यूltra - centrifugation गोली नमूना. एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर 2X में β-mercaptoethanol 10μl 5% के साथ प्रत्येक नमूने से 10μl मिक्स. लोड 15% एसडीएस पृष्ठ पर नमूने और 180 वोल्ट में 45 मिनट के लिए चला.
  17. InstantBlue समाधान के 15 मिलीलीटर में जेल दाग, 1 घंटे के लिए हिला. यकीन है कि प्लास्टिक बॉक्स कवर और प्रकाश से सुरक्षित है.
  18. जेल मूल्यांकन, यदि प्रोटीन अभिव्यक्ति संकेत बैंड के अनुसार उच्च और विशिष्ट है, चयनित eluted भिन्न मर्ज.
  19. आदेश में 10-उनके टैग - हटाने के लिए, गोजातीय थ्रोम्बिन (10 इकाइयों / μl), 1 मिलीग्राम प्रोटीन प्रति 10μl थ्रोम्बिन निर्माता संयुक्त नमूना करने के लिए सिफारिश के अनुसार, जोड़ने.
  20. डायलिसिस अतिरिक्त imidazole हटाने के लिए प्रयोग किया जाता है और आयन एक्सचेंज बंधन के दौरान आवश्यक स्तरों के लिए NaCl सांद्रता में कमी. डायलिसिस के लिए, 7 केडी आणविक वजन के वांछित लंबाई काट (MWCO) डायलिसिस टयूबिंग काटा. DDW से धो और एक अंत (या क्लिप के साथ मुहर) में एक गाँठ बनाने. बैग पर मर्ज प्रोटीन समाधान स्थानांतरण, जबकि शीर्ष पर कुछ जगह छोड़ने और दबाना.
  21. डूब 4 लीटर ठंडा डायलिसिस बफर में डायलिसिस टयूबिंग (बफर डी). रात में धीरे धीरे 277 समाधान ° हिलाओ के.एच.
  22. बीकर के डायलिसिस टयूबिंग बाहर ले लो, एक छोटे से काट कर और 50ml ट्यूब के लिए प्रोटीन के हस्तांतरण.
  23. आयन - विनिमय क्रोमैटोग्राफी: फास्ट प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) पर पूर्व पैक MonoQ 4.6/100 पीई स्तंभ को इकट्ठा. 5 DDW फ़िल्टर्ड पानी के स्तंभ मात्रा (CV) के साथ स्तंभ धो लें. बफर डी. के 5 CV के साथ Equilibrated स्तंभ
  24. DDW (दो पाश संस्करणों) के साथ इंजेक्शन पाश धो और इंजेक्शन पाश में प्रोटीन लोड बफर डी. के साथ दोहराने.
  25. प्रोटीन नमूना (1 मिलीग्राम / मिनट की दर प्रवाह) इंजेक्षन और असीम प्रोटीन का पता लगाने के एसडीएस पृष्ठ के लिए भिन्न संग्रह शुरू.
  26. यदि प्रारंभिक प्रोटीन की मात्रा (3.23 कदम) इंजेक्शन पाश से बड़ा है, 3.25-3.26 कदम दोहराने के लिए, पाश धोने के बिना, जब तक पूरे नमूना स्तंभ पर भरी हुई है.
  27. 3 बफर सी के CV के साथ स्तंभ क्रम में असीम प्रोटीन को दूर धो.
  28. डी और ई (जब 100% बफर ई ढाल के अंत है), प्रवाह दर 1 / मिलीलीटर (मिनट buffers के बीच एक 60 मिनट 40 NaCl 2000mm रैखिक ढाल के साथ प्रोटीन Elute हालांकि उच्च प्रवाह दरों की लागत में इस्तेमाल किया जा सकता है बड़ी मात्रा में है, लेकिन कम केंद्रित है, प्रोटीन चोटियों). लीजिए प्रोटीन चोटियों के रूप में वे 280nm chromatogram में दिखाई देते हैं.
  29. साफ़ पूर्व पैक स्तंभ सिफारिश निर्माण करने के लिए अनुसार.
  30. एसडीएस पृष्ठ एकत्र भिन्न का विश्लेषण. इस तरह के विश्लेषण के लिए निम्न नमूनों को के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए, असीम प्रोटीन प्रवाह के माध्यम से और प्रोटीन चोटियों प्रवाह के माध्यम से. एसडीएस पृष्ठ भागो और दाग के रूप में 3.17-3.18 चरणों में उल्लेख.
  31. भविष्यवाणी मेगावाट पर पूर्व से सना हुआ प्रोटीन मार्कर के अनुसार प्रोटीन बैंड अस्तित्व के लिए जेल मूल्यांकन. चयनित elution भिन्न है कि प्रासंगिक प्रोटीन होते मर्ज.
  32. मर्ज किए गए नमूने Dialyze, क्रम में NaCl आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के लिए की जरूरत सांद्रता कम करने के लिए. डायलिसिस के रूप में बफर एफ के खिलाफ 3.21-3.23 चरणों में उल्लेख किया प्रदर्शन
  33. ध्यान प्रोटीन नमूना Vivaspin-15 दस हज़ार MWCO 8 मिलीग्राम / एक मेज अपकेंद्रित्र, 4000 rpm में मिलीलीटर का उपयोग 280nm पर क्वार्ट्ज क्युवेट में आयुध डिपो को मापने के द्वारा इच्छा एकाग्रता मान्य. यदि प्रोटीन भी ध्यान केंद्रित किया है यह बफर एफ के साथ पतला और फिर से मापने के.
  34. आकार अपवर्जन पूर्व पैक स्तंभ, HiLoad 26/60 200 FPLC पर Superdex इकट्ठा, DDW फ़िल्टर्ड पानी की 3 CV के साथ स्तंभ धोने. बफर एफ के 3 CV के साथ Equilibrated स्तंभ
  35. बफर एफ के साथ एक ही मात्रा द्वारा पीछा 5ml DDW (दो पाश संस्करणों) के साथ इंजेक्शन पाश धो इंजेक्शन पाश में प्रोटीन नमूना का कोई अधिक से अधिक 4 मिलीलीटर लोड.
  36. प्रोटीन नमूना (3.5 मिलीलीटर / मिनट के प्रवाह की दर) इंजेक्षन और के रूप में वे इसे 280nm chromatogram प्रकट प्रोटीन चोटी भिन्न संग्रह शुरू. बफर प्रवाह चलो जब तक यह स्तंभ मात्रा पहुँचता है.
  37. यदि प्रारंभिक प्रोटीन की मात्रा (3.23 कदम) इंजेक्शन पाश से बड़ा है, 3.25-3.26 कदम दोहराने के लिए, पाश धोने के बिना, जब तक पूरे नमूना स्तंभ पर भरी हुई है.
  38. साफ़ पूर्व पैक स्तंभ निर्माण की सिफारिश के अनुसार.
  39. एसडीएस पृष्ठ एकत्र भिन्न का विश्लेषण. इस तरह के विश्लेषण प्रोटीन चोटियों नमूनों के साथ किया जाना चाहिए. एसडीएस पृष्ठ भागो और दाग के रूप में 3.17-3.18 चरणों में उल्लेख.
  40. मूल्यांकन जेल: अगर प्रोटीन चोटियों विशिष्ट हैं, प्रोटीन मार्कर पूर्व से सना हुआ और केवल एक बैंड के अनुसार सही भविष्यवाणी मेगावाट में मर्ज चयनित प्रासंगिक प्रोटीन की eluted भिन्न दिखाई है.
  41. प्रोटीन> 20 मिलीग्राम / एक तालिका अपकेंद्रित्र में मिलीलीटर, 4000 rpm के लिए नमूना का उपयोग Vivaspin 15 १०,००० MWCO ध्यान लगाओ. आयुध डिपो को मापने के द्वारा 280nm पर इच्छा एकाग्रता मान्य. शुद्ध MamAΔ41 तो 26.5 मिलीग्राम / crystallization के लिए मिलीलीटर ध्यान केंद्रित किया गया था.
    42. <li> नमूना पवित्रता और प्रोटीन की पहचान मैट्रिक्स की मदद से desorption लेजर / ionization (MALDI-TOF) का उपयोग कर पुष्टि करें.
  42. 25-50μl प्रत्येक में प्रोटीन, यदि प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमीटर और एसडीएस पृष्ठ के अनुसार शुद्ध होता है, पूर्व चिह्नित Eppendorf ट्यूबों के लिए ध्यान केंद्रित MamAΔ41 विभाजित.
  43. फ़्लैश 193 लालकृष्ण ° पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में जमे हुए

4. प्रतिनिधि परिणाम

जब इस प्रोटोकॉल सही ढंग से किया जाता है एक उच्च शुद्ध, आकार समरूप और केंद्रित प्रोटीन के नमूने प्राप्त करना चाहिए. ये प्रोटीन के नमूने तो crystallization परीक्षण के लिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जैसे जैव रासायनिक अध्ययन, एंजाइम कैनेटीक्स, बंधन आत्मीयता और अधिक तैयार कर रहे हैं. यहाँ वर्णित हैं शुद्धि प्रोटोकॉल में मुख्य कदम के प्रतिनिधि परिणाम. एसडीएस पृष्ठ नी NTA आत्मीयता स्तंभ के elution प्रोफ़ाइल के विश्लेषण के उच्च घुलनशील प्रोटीन अंश में व्यक्त 22kDa ~ (चित्रा 1) के उचित मेगावाट प्रकट करना चाहिए. यह विश्लेषण एसडीएस पृष्ठ भी कम से कम पता चलता है अगर किसी भी प्रोटीन, प्रवाह के माध्यम से असीम प्रोटीन में के माध्यम से प्रवाह और अल्ट्रा centrifugation गोली नमूना धोने चाहिए. यदि उचित प्रोटीन के बड़े बैंड इन नमूनों में दिखाई देते हैं एक गलत बफर तैयारी, सेल व्यवधान या ऑटो प्रेरण संस्कृति की स्थिति और विकास में समस्याओं में समस्याओं पर विचार करना चाहिए.

आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी क्रम में हमारे वांछनीय प्रोटीन के बीच अन्य ई. कोलाई प्रोटीन है कि निकल राल (electrostatic बातचीत या हिस्टडीन / नकारात्मक अमीनो एसिड अमीर प्रोटीन छोरों के कारण) और काटा हुआ उनका टैग्ड वांछनीय प्रोटीन के लिए बाध्य किया गया करने के लिए अलग preformed है . यह कॉलम उनकी बढ़ती NaCl सांद्रता के तहत सकारात्मक आरोप लगाया राल बंधन आत्मीयता के अनुसार प्रोटीन को अलग करती है. अत्यधिक नकारात्मक आरोप लगाया प्रोटीन और उच्च NaCl सांद्रता में elute मध्यम नकारात्मक आरोप लगाया लोगों appose होगा. इस स्तंभ के लाभ उच्च प्रवाह की दर और बाध्यकारी क्षमता हैं. आयन एक्सचेंज (चित्रा 2) chromatogram 3 NaCl एकाग्रता बढ़ाने में प्रोटीन आबादी के बीच एक अच्छा जुदाई से पता चलता है. एसडीएस - PAGE विश्लेषण की जरूरत है आदेश में प्रत्येक आबादी का मेगावाट निर्धारित करने के लिए, वांछनीय एक और मूल्यांकन है कि क्या आगे शुद्धि कदम की जरूरत है अलग है. पहली जनसंख्या MamAΔ41 (~ 20 केडीए) है, जबकि दूसरा जनसंख्या MamAΔ41 + उनकी (22kDa ~) टैग है कि गोजातीय थ्रोम्बिन द्वारा नहीं cleaved किया गया था और तीसरे जनसंख्या कम एकाग्रता के कारण एसडीएस PAGE में undetectable है. यदि प्रोटीन चोटियों को स्पष्ट रूप से अलग नहीं कर रहे हैं एक गलत बफर तैयारी पर विचार या NaCl ढाल के ढलान को बदलने चाहिए.

आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी क्रम में हमारे अन्य ई. कोलाई कोशिका प्रोटीन है कि नी - NTA राल के लिए बाध्य किया गया और क्रोमैटोग्राफी आयन एक्सचेंज के दौरान अलग नहीं थे करने के लिए वांछनीय प्रोटीन के बीच अलग preformed है. इस स्तंभ को उनके आकार के अनुसार प्रोटीन को अलग करती है. बड़े प्रोटीन छोटे elution छोटे हैं जो बड़ी मात्रा में eluted जाएगा करने का विरोध किया मात्रा में elute जाएगा. स्तंभ chromatogram (चित्रा 3) एक मुख्य आबादी के रूप में वांछनीय प्रोटीन का एक अच्छा जुदाई से पता चलता है. जनसंख्या ~ 20 केडीए के एक मेगावाट के साथ उचित monomer के आकार में elute प्रकट होता है. ~ 80 केडीए बैंड (ई. कोलाई विशिष्ट प्रोटीन है कि नी - NTA राल बांध) की उपस्थिति एसडीएस पृष्ठ में पता चला है पहले स्तंभ लोड हो रहा है और इस दौड़ के दौरान गायब हो जाता है . चूंकि इस ~ 80 केडीए प्रोटीन की एकाग्रता के साथ शुरू करने के लिए कम है, इसकी जनसंख्या के कारण chromatogram में इसके कमजोर पड़ने और एसडीएस PAGE विश्लेषण शुद्धि दक्षता का निर्धारण करने की जरूरत है प्रकट नहीं होता. हम मुख्य चोटी के एसडीएस पृष्ठ एक पतला और केंद्रित नमूना लोड हो रहा है तो एक निश्चित रूप से उपयुक्त मेगावाट में शुद्ध प्रोटीन की उपस्थिति निर्धारित कर सकते हैं सलाह देते हैं. इस चरण में प्रोटीन और शुद्ध है अपने एकरूपता MALDI-TOF द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए. इस विश्लेषण 20347 दा और 10,176 दा (चित्रा 4) के मेगावाट में एक मेगावाट में एक प्रोटीन का पता चला. ~ 10 केडीए प्रोटीन है ~ 20 केडीए प्रोटीन का आरोप लगाया दोगुनी. नौ अमीनो एसिड के साथ उनकी - टैग हटाने के बाद छोड़ दिया MamAΔ41 की भविष्यवाणी मेगावाट 20596.5 दा था. हम इसे प्राप्त MALDI-TOF मेगावाट की तुलना करके पाया है कि वे 248 के अलावा डा हैं. इस विषमता MALDI-TOF माप त्रुटियों और / या पहली methionine के आम गिरावट और दूसरा ग्लाइसिन वजह से परिणाम कर सकते हैं. समाप्त करने के लिए, प्रोटीन अत्यधिक शुद्ध होता है आगे के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

तालिका 1
तालिका 1 बफर योगों.

चित्रा 1
चित्रा 1. नी NTA स्तंभ शुद्धि के प्रतिनिधि एसडीएस पृष्ठ का विश्लेषण बाएं से दाएं, पी अल्ट्रा - अपकेंद्रित्र गोली (3.11 प्रोटोकॉल कदम), डब्ल्यू धोने (3.12 प्रोटोकॉल कदम), यू असीम प्रोटीन (3.10 प्रोटोकॉल कदम), ई - elution samp के पांच गलियोंलेस (3.14 प्रोटोकॉल कदम), एम - प्रोटीन मार्कर (संख्या मेगावाट से संकेत मिलता है). तीर इंगित करता है MamAΔ41.

चित्रा 2
चित्रा 2. आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी कदम () आयन एक्सचेंज (MonoQ स्तंभ) chromatogram का विश्लेषण, ब्लू - एकत्र भिन्न का संकेत - अवशोषण 280nm, प्रोटीन एकाग्रता, ग्रीन NaCl एकाग्रता, रेड का प्रतिनिधित्व करता है. (ख) आयन एक्सचेंज शुद्धि कदम के प्रतिनिधि एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण. बाएँ से दाएँ, एम - प्रोटीन मार्कर (संख्या मेगावाट से संकेत मिलता है), A6 - पहली शिखर अंश, A8 दूसरा शिखर अंश.

चित्रा 3
चित्रा 3. आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण () का आकार (Superdex 200 स्तंभ) अपवर्जन chromatogram, ब्लू - अवशोषण 280nm, प्रोटीन एकाग्रता, एकत्र भिन्न के लाल संकेत का प्रतिनिधित्व करता है. (ख) आकार अपवर्जन शुद्धि कदम के प्रतिनिधि विश्लेषण एसडीएस पृष्ठ. बाएँ से दाएँ, एम प्रोटीन मार्कर, (संख्या मेगावाट से संकेत मिलता है) PreI पूर्व इंजेक्शन नमूना, A4-6 संयुक्त चोटी से पहले एकत्र अंश A4 6D - पतला अंश चोटी से एकत्र की.

चित्रा 4
चित्रा 4. मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption / ionization (MALDI-TOF) MamAΔ41 शुद्ध जन स्पेक्ट्रम. मैट्रिक्स Sinapic एसिड (एसए) है. MamAΔ41 20347 दा में दिखाया गया है, यह भी पता चला है दोगुनी दा 10176 पर आरोप लगाया MamAΔ41 की प्रजातियों है.

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Discussion

प्रोटीन शुद्धीकरण किसी भी जैव रासायनिक प्रोटीन या संरचनात्मक अध्ययन में मुख्य कदम है. चूंकि प्रत्येक प्रोटीन अपने स्वयं के व्यवहार के साथ अद्वितीय है, उसके गुणों को परिभाषित करने के लिए और इसकी शुद्धि तदनुसार संशोधित करने की जरूरत है. प्रोटीन लक्ष्य bioinformatics उपकरणों का उपयोग कर शुद्धि की ओर एक पहला कदम के रूप में विश्लेषण किया जाना चाहिए. वे लक्ष्य बिंदु आईएसओ बिजली की गणना करने के लिए, पर्यावरण और विशेष आयनों / ligands के लिए अपनी जरूरत को कम करने / ऑक्सीकरण के लिए अपनी जरूरत का आकलन किया जाता है. हमारे प्रोटोकॉल के कई महत्वपूर्ण संशोधन जो लक्ष्य विशिष्टता को प्रतिबिंबित कर रहे हैं. इन संशोधनों बफर, काम कर रहे तापमान और स्तंभ समायोजन शामिल हैं.

पहला महत्वपूर्ण संशोधन बफर (3.3 अनुभाग) के उपयोग में ऐसे बफ़र्स सही पीएच रेंज / आयनों और ligands और ईओण प्रोटीन स्थिरता और कार्यों के लिए आवश्यक शक्ति को प्रतिबिंबित करने के लिए बदले जाने की जरूरत है. यदि लक्ष्य अस्थिरता के किसी भी हस्ताक्षर (गिरावट, वर्षा, या समारोह के नुकसान) से पता चलता है एक परीक्षण और अन्य अधिक उपयुक्त बफ़र्स के लिए खोज करने की जरूरत है. एक अन्य महत्वपूर्ण मुद्दा शुद्धि गति और काम कर रहे तापमान है. के रूप में एक प्रोटीन गिरावट (proteases या प्रोटीन के भीतर अस्थिरता के कारण) से बचने का मतलब है कि तेजी से शुद्धि 277 पर प्रदर्शन करना चाहिए ° कश्मीर (ठंड बफ़र्स, रोटार और स्तंभों का उपयोग सहित).

आत्मीयता शुद्धि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कदम अन्य क्रोमैटोग्राफी चरणों राल विभिन्न स्रोतों पर प्रदर्शन किया जा सकता है. संबंध राल प्रोटीन कई तकनीकों का उपयोग कर लोड कर सकते हैं और यह स्थानीय सेटिंग के आधार पर बदल दिया जाना चाहिए. यदि यह अधिक प्रोटीन समाधान पारित करके राल भरी हुई है, एक धीमी गति से प्रवाह (1-1.5 मिलीग्राम / मिनट) का उपयोग करने के लिए अधिकतम प्रोटीन पर कब्जा सुनिश्चित करना चाहिए. (प्रोटीन समाधान के साथ राल मिश्रण) बैच बाइंडिंग के लिए एक 277 पर कमरे के तापमान पर ~ 10 मिनट ऊष्मायन और अब (1 घंटे) की अनुमति की जरूरत ° लालकृष्ण आत्मीयता ताकत के आधार पर, राल धोने विभिन्न imidazole सांद्रता के तहत किया जा सकता है.

कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल में प्रत्येक चरण के परिवर्तन जगह लेने के क्रम में कुशलता अद्वितीय प्रोटीन विचाराधीन एक गाइड के रूप में इस शुद्धीकरण योजना लेने लक्ष्य शुद्ध होना चाहिए.

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Acknowledgments

हम अपने और उनकी सलाह और टिप्पणियों के लिए समर्थन Geula Davidov, नोम Grimberg और चेन Guttman के लिए डॉ. आमिर Aharoni स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
French Press Equipment Thermo Fisher Scientific, Inc. FA-078A
Pressure cell Equipment Thermo Fisher Scientific, Inc. FA-032
Ultra-centrifuge Equipment Sorvall, Thermo Scientific Discovery 90SE
Rottor Equipment Beckman Coulter Inc. Ti60
Ultra-centrifuge tubes; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml Equipment Beckman Coulter Inc. BC-355618
2.5cm diameter, Glass Econo-Column Chromatography Columns Equipment Bio-Rad 737-2521
Ni-NTA His Bind resin Equipment Novagen, EMD Millipore M0063428
Spectrophotometer Equipment Amersham Ultraspec 2100 pro
Quartz cuvette Equipment Hellma 104-QS
Fast Performance Liquid Chromatography- AKTA purifier 10 Equipment GE Healthcare 28-4062-64
Ion exchange column – MonoQ 4.6/100 PE Equipment GE Healthcare 10025543
Size exclusion pre-packed column-HiLoad 26/60 Superdex 200 Equipment GE Healthcare 17-1071-01
Centricon - Vivaspin15 – 10,000 MWCO Equipment Sartorius AG VS1501
Table centrifuge Equipment Thermo Fisher Scientific, Inc. IEC CL30R
MALDI-TOF Equipment Bruker Corporation Reflex IV
Tris-HCl (hydrotymethyl) aminomethane Reagent BioLab 20092391
Sodium Chloride Reagent FRUTROM 235553470
Imidazole Reagent Alfa Aesar 288-32-4
EDTA free protease inhibitors cocktail Reagent Sigma-Aldrich P-8849
Dnase I (Deoxyribonuclease I) Reagent Sigma-Aldrich DN-25
Bovine Thrombin Reagent Fisher Scientific BP25432
Glycine Reagent BioLab 07132391
Soudim Dodecyl Sulfate (SDS) Reagent BioLab 19822391
Beta-mercapt–thanol Reagent Sigma-Aldrich M-3148
InstantBlue Reagent Expedeon 1SB01L
PageRuler Prestained Protein Ladder Reagent Fermentas SM0671

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References

  1. Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic Bacteria and Magnetosomes. Chem Rev. 108, 4875-4898 (2008).
  2. D'Andrea, L. D., Regan, L. TPR proteins: the versatile helix. Trends Biochem Sci. 28, 655-662 (2003).
  3. Young, J. C., Barral, J. M., Hartl, U. lrich, F, More than folding: localized functions of cytosolic chaperones. Trends Biochem Sci. 28, 541-547 (2003).
  4. Brocard, C., Hartig, A. Peroxisome targeting signal 1: is it really a simple tripeptide? Biochim Biophys Acta. 1763, 1565-1573 (2006).
  5. Fransen, M., Amery, L., Hartig, A., Brees, C., Rabijns, A., Mannaerts, G. P., Van Veldhoven, P. P. Comparison of the PTS1- and Rab8b-binding properties of Pex5p and Pex5Rp/TRIP8b. Biochim Biophys Acta. 1783, 864-873 (2008).
  6. Baker, M. J., Frazier, A. E., Gulbis, J. M., Ryan, M. T. Mitochondrial protein-import machinery: correlating structure with function. Trends Cell Biol. 17, 456-464 (2007).
  7. Mirus, O., Bionda, T., von Haeseler, A., Schleiff, E. Evolutionarily evolved discriminators in the 3-TPR domain of the Toc64 family involved in protein translocation at the outer membrane of chloroplasts and mitochondria. J Mol Model. 15, 971-982 (2009).
  8. Gatsos, X., Perry, A. J., Anwari, K., Dolezal, P., Wolynec, P. P., Likic, V. A., Purcell, A. W., Buchanan, S. K., Lithgow, T. Protein secretion and outer membrane assembly in Alphaproteobacteria. FEMS Microbiol Rev. 32, 995-1009 (2008).
  9. Tiwari, D., Singh, R. K., Goswami, K., Verma, S. K., Prakash, B., Nandicoori, V. K. Key residues in Mycobacterium tuberculosis protein kinase G play a role in regulating kinase activity and survival in the host. J Biol Chem. 284, 27467-27479 (2009).
  10. Edqvist, P. J., Broms, J. E., Betts, H. J., Forsberg, A., Pallen, M. J., Francis, M. S. Tetratricopeptide repeats in the type III secretion chaperone, LcrH: their role in substrate binding and secretion. Mol Microbiol. 59, 31-44 (2006).
  11. Grunberg, K., Muller, E. C., Otto, A., Reszka, R., Linder, D., Kube, M., Reinhardt, R., Schuler, D. Biochemical and proteomic analysis of the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Appl Environ Microbiol. 70, 1040-1050 (2004).
  12. Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 3839-3843 (2004).
  13. Okuda, Y., Fukumori, Y. Expression and characterization of a magnetosome-associated protein, TPR-containing MAM22, in Escherichia coli. FEBS Lett. 491, 169-173 (2001).
  14. Taoka, A., Asada, R., Sasaki, H., Anzawa, K., Wu, L. F., Fukumori, Y. Spatial localizations of Mam22 and Mam12 in the magnetosomes of Magnetospirillum magnetotacticum. J Bacteriol. 188, 3805-3812 (2006).
  15. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).

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सेलुलर जीवविज्ञान 37 अंक पुनः संयोजक प्रोटीन शुद्धीकरण magnetotactic बैक्टीरिया magnetosome माँ
के शोधन<em> एम. magneticum</em> तनाव Magnetosome एसोसिएटेड प्रोटीन MamAΔ41-1 AMB
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Zeytuni, N., Zarivach, R.… More

Zeytuni, N., Zarivach, R. Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAΔ41. J. Vis. Exp. (37), e1844, doi:10.3791/1844 (2010).

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