تسجيلات صفيف Multielectrode من الطلائية الميكعي

Summary

Multielectrode صفيف (MEA) التسجيلات توفر طريقة لدراسة النشاط الكهربائي لأعداد كبيرة من الخلايا العصبية. هنا ، فإننا نقدم تفاصيل التحضير لتسجيل شركة طيران الشرق الأوسط من ظهارة الميكعي الماوس في وقت واحد بينما تحفيز الأنسجة.

Abstract

فهم الدارات العصبية يتطلب أساليب لتسجيل العديد من الخلايا العصبية في وقت واحد. إلى

Protocol

الجزء 1. الأجهزة الكهربائية تسجيل

1. نحن نستخدم مجموعة multielectrode مستو (ALA الآلات العلمية) مع 10 ميكرومتر شقة أقطاب نيتريد التيتانيوم معزولة مع نيتريد السيليكون. مرتبة 60 في حقلين كهربائي يتألف من شبكة 5x6 مع مركز إلى مركز تباعد من 30 ميكرون. (تكوينات أخرى من الممكن أيضا ؛ كهربائية مع سطح تسجيل 10 ميكرومتر في القطر هي أفضل من أكبر الأقطاب من حيث عزل نشاط الخلايا العصبية واحدة.)
2. وتتضخم الإشارات الكهربائية (التضخيم 1000x) باستخدام مكبر للصوت الشرق الأوسط وأفريقيا 1060 (ALA الأدوات العلمية). يتم الحصول على إشارات في 10 كيلوهرتز باستخدام بطاقة الحصول على البيانات (الصكوك الوطنية) وبرنامج مخصص للحصول على البيانات (واحد يمكن أيضا شراء البرمجيات التجارية).
3. يقام في الأنسجة أسفل على MEA بواسطة شبكة من النايلون (53 ميكرون) ، وهو يعلق على إدراج مخصص الذي يلائم بشكل مريح داخل أنبوب الثقافة خاتم من الشرق الأوسط وأفريقيا.

الجزء 2. السائلة تسليم الأجهزة

1. النسيج يتطلب superfusion المستمر ، الذي يضمن لنا من خلال تقديم حل رينغر (115 كلوريد الصوديوم ملم ، وكلوريد البوتاسيوم 5 ملم ، 2 كلوريد الكالسيوم ملم ، 2 كلوريد المغنيسيوم مم ، 25 بيكربونات الصوديوم مم ، 10 HEPES ملم ، و 10 ملي D - (+ ) - الجلوكوز) من مضخة HPLC. يتم تقديم المحفزات التي تؤدي إلى حقن صمام HPLC والتبديل بين والتدفق من خلال حلقة. يتم تزويد كل مضخة HPLC ومضخة حقن الروبوت في المحاقن مع حل رينغر.
2. يبقى الحل الجرس في حمام ماء ساخن (ISOTEMP 105) في 42 درجة مئوية في كافة مراحل التجربة ، وانفجر بشكل مستمر مع 95 ٪ O ₂ / 5 ٪ CO _2. ويتم إعداد دورق منفصل من دون رينغر في الجلوكوز لدعم ضخ حقنة. يتم تسليم الحل الجرس على النسيج باستخدام 307 مضخة HPLC (جيلسون) بمعدل 3 مل / دقيقة. في تجربة نموذجية ساعة 5-6 ، 1 لتر من محلول كل رينغر كافية.
3. في كافة مراحل التجربة ، هو نسيج superfused باستمرار مع حل درجة مئوية رينغر 37. يتم وضع مسبار سخان مباشرة فوق الأنسجة.
4. يتم تسليم المحفزات السائلة باستخدام معالج 215 جيلسون ذراع روبوتية. يتم تخزين المحفزات في قوارير زجاجية المطاط المغطاة ، وتحت سيطرة البرمجيات جيلسون ، الذراع الروبوتية يسلم المحفزات إلى خط نضح في حين يتم الاحتفاظ معدل التدفق المستمر والضغط.
5. ويمثل حالة صمام HPLC (حلقة تعمل / لا تعمل) عن طريق الجهد الكهربائي ، والتي يتم تسجيلها من قبل الكمبيوتر اقتناء كقناة إضافية لضمان تزامن مع نشاط الخلايا العصبية.

الجزء 3. إعداد شركة طيران الشرق الأوسط والتحفيز الأجهزة التسليم

1. قبل أداء التشريح ، وملء MEA جيدا مع جيش صرب البوسنة في dH2O ما لا يقل عن 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2. شطف MEA باستخدام الدافئة فقاعات رينغر الحل ووضع شركة طيران الشرق الأوسط على الجليد.
3. رئيس معالج السائلة وHPLC مضخة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

الجزء 4. VNO تشريح

1. قبل أداء التشريح ، وملء 2 60x15 ملم أطباق بتري مع الحل رينغر فقاعات ومكان على الجليد. شغل أيضا 2 Sylgard المغلفة أطباق بتري من نفس الحجم مع الحل رينغر ومكان على الجليد. البرد an 50mL إضافية الدافئة انفجر في رينغر للاستخدام أثناء تشريح.
2. وضحى الماوس عبر الخنق CO ₂ تليها خلع عنق الرحم.
3. جعل شقوق الثنائية من جانب الفم ، وبالتوازي مع خط الفك السفلي ، والجزء الخلفي من الرأس. الانضمام إلى خفض 2 على طول الظهر والعنق وإزالة الجزء الظهري للرأس ، وترك الفك السفلي تعلق على الماوس.
4. غرامة باستخدام مقص ، وقطع الأنسجة وبين جانبي عظم الفك العلوي لفصل الأنسجة من العظام.
5. # 3 باستخدام الملقط ، تقشر الأنسجة الحنك لفضح تجويف الأنف.
6. باستخدام مقص أو مشرط صغير ، وبين قطع على جانبي الأسنان الأمامية العلوية 2 لتحرير الميكعي كبسولة من العظام.
7. # 3 باستخدام الملقط ، التقط كبسولة الميكعي من العظام المسطحة وضعها في طبق بتري على الجليد. يجب أن يتم تنفيذ الخطوات حتى من خلال الانغماس في اقل من 3 دقائق.
8. وضع صحن تحت stereomicroscope ، مضاءة مع الضوء المنعكس. إزالة الكبسولة العظمي من VNO في وقت واحد باستخدام الملقط # 3. استخدم يدا واحدة لتحقيق الاستقرار في الكبسولة التي تجتاح عظمي من نهاية الذيل واليد الأخرى لقشر العظم بعيدا عن VNO ، مع الحرص على عدم الإضرار VNO.
9. عندما تتم إزالة العظام ، ونقل إلى VNO طبق بيتري Sylgard المغلفة. استخدام طبق المتبقية لVNO الأخرى. تبديل الإضاءة الخفيفة لإرسالها.
10. باستخدام مقص أو الجزئي ملقط # 5 ، فصل VNO من الاوعية الدموية عن طريق خفض طول حافة VNO. عند هذه النقطة سوفلقد ورقة منفصلة تماما عن العصبية والأوعية الدموية.
11. ضع VNO مع الجانب الداخلي حتى (شجيري). # 3 باستخدام الملقط ، ومرساة VNO إلى Sylgard في زاوية من الأنسجة. قشر ظهارة عصبية من الصفيحة القاعدية باستخدام قطعة صغيرة من شفرة حلاقة تفلون المغلفة التي عقدت مع المشبك. عقد شفرة بزاوية ضحلة (<30 درجة من سطح الطبق) هو أفضل.
12. باستخدام ماصة الزجاج ، ونقل قطعة من الظهارة العصبية من الطبق إلى الشرق الأوسط وأفريقيا. موقف VNO على رأس الحقل الكهربائي مع الجانب شجيري يصل. الحل إزالة الزائدة مع رينغر ماصة. مكان صاحب شبكة نسيج في البئر للصفيف لعقد VNO في مكان ، وملء مع الحل رينغر مبردة ل.

الجزء 5. تسجيل

1. وضع شركة طيران الشرق الأوسط في شركة طيران الشرق الأوسط 1060 مكبر للصوت وموقف لجنة التحقيق سخان مباشرة فوق الأنسجة.
2. الموضع الصحيح لتأكيد التحقيق جهاز التدفئة ، مع تحفيز حل رينغر البوتاسيوم يحتوي على 50 ملم (الاستعاضة عن الصوديوم متساوي المولية) لمدة 2 ثانية. ضبط تحديد المواقع للحد من الكمون للاستجابة العصبية في حل البوتاسيوم.
3. Superfuse النسيج بمحلول رينغر ساخنة لمدة 45 دقيقة الى 1 ساعة قبل تسجيل للسماح للأنسجة حتى يتأقلم.
4. يتم حفظ الإشارات الكهربائية إلى القرص باستخدام برامج مخصصة التسجيل.

الجزء 6. تحليل البيانات

1. ويمكن أن يتم حاليا تحليل البيانات باستخدام التسجيلات القطب الخام. على سبيل المثال ، فإننا قياس التغيرات معدل إطلاق الخلايا المسجلة في استجابة ليغاندس معينة. مجموعات البيانات الناتجة تكون كبيرة ، ويمكن استخدامها لمعالجة مسائل مختلفة كثيرة ، مطلوب الألفة مع لغة البرمجة أو التحليل (C ، ماتلاب ، R ، بيثون ، أو ما شابه ذلك).

الجزء 7. ممثل النتائج

هذا التحضير هو عادة مستقرة بما يكفي لتسجيل من أجل 6 ساعات ، مما يعني أن كمية كبيرة من البيانات (6 ساعات من التسجيل من أقطاب 60).

الشكل 1. تظهر لقطة من النشاط في وقت واحد عبر واحد من نصف الصفيف. نافذة الوقت يمتد 400 مللي ثانية. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.

الشكل 2 في تجربة نموذجية ، ونحن حفز مع مركبات معينة من الفائدة لمدة 10 ثانية. تتبع هذا هو مثال للاستجابة الى 100 أضعاف البول المخفف فئران. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2.

Discussion

تسجيلات الصفيف Multielectrode تسمح لنا القدرة على رصد النشاط المتزامن لعدد كبير من الخلايا العصبية. هذا هو أداة مفيدة لبحث خصائص النظام الحسي ، وتحديدا VNO. على عكس النظام الشمية الرئيسية ، ويكشف VNO المحفزات في المرحلة السائلة. إضافة إلى ذلك ، VNO هو نسيج غير متجانس. هناك ما يقرب من 300 أنواع مختلفة من المستقبلات في الماوس ¹ ، ويفترض مع التشكيلات استجابة مختلفة. تسجيلات الشرق الأوسط وأفريقيا مجتمعة مع الذراع الروبوتية تسمح لنا لتقديم المحفزات السائلة موثوق بها لعدد كبير ومتنوع من الخلايا العصبية والهوية استجابة electrophysiologically. بالإضافة إلى ذلك ، للاستقرار في VNO في المختبر يسمح الوقت لتكرار متعددة من التحفيز.

سابقا ، وقد استخدمت هذه التقنية لتحقيق الخصائص الحسية للVSNs ردا على البول الماوس ² وكذلك باعتبارها بمثابة تجربة موثوقة لتحديد يغاندس الفردية الموجودة في البول ^3. في المستقبل ، قد تكون هذه التقنية مفيدة للغاية لاكتشاف المزيد من ويجند في وصف الخصائص الحسية للVNO.