Многоэлектродной массива Записи вомероназального Эпителий

Summary

Многоэлектродной массива (МЭС) записи обеспечивают метод для изучения электрической активности больших популяций нейронов. Здесь мы представляем подробности подготовки МЭС для записи с мышью вомероназального эпителия одновременно стимулирует ткани.

Abstract

Понимание нейронных цепей требует методов для записи от многих нейронов одновременно. Для

Protocol

Часть 1. Электрические инструментария Запись

1. Мы используем плоского массива многоэлектродной (ALA Scientific Instruments) с 10 мкм плоский нитрида титана электроды изолированы нитрида кремния. 60 электродов расположены два поля, состоящего из 5x6 сетка с центра до центра шагом 30 мкм. (Другие конфигурации также возможны; электроды с записанной поверхности 10 мкм в диаметре лучше, чем больше электродов в условиях изоляции активности отдельных нейронов.)
2. Электрические сигналы усиливаются (1000x усиления) с использованием МЭС 1060 усилитель (ALA Scientific Instruments). Сигналы, полученные в 10 кГц при помощи карты сбора данных (National Instruments) и пользовательские сбора данных программного обеспечения (можно также приобрести в магазине программного обеспечения).
3. Ткань удерживается на МЭС нейлоновая сетка (53 мкм), который прилагается к Специальная вставка которая плотно облегает внутри кольца культуры трубки МПС.

Часть 2. Жидкие инструментария доставки

1. Ткани требует постоянного superfusion, которые мы гарантируем, поставляя раствор Рингера (115 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлористого калия, 2 мМ хлорида кальция, 2 мМ хлорид магния, 25 мМ бикарбоната натрия, 10 мМ HEPES, и 10 мМ D-(+ )-глюкоза) из насоса ВЭЖХ. Стимулы представлены выполнения инъекций в клапан жидкостной хроматографии и переключение между проточным и петли. Оба насоса ВЭЖХ и шприцевой насос инъекции робота поставляются с раствором Рингера.
2. Раствор Рингера хранится в отапливаемом водяной бане (ISOTEMP 105) при 42 ° С в течение всего эксперимента и постоянно пропускают с 95% O ₂ / 5% СО _2. Отдельные колбу Рингера без глюкозы готова для резервного шприцевой насос. Раствор Рингера доставляется на ткани с помощью 307 ВЭЖХ насос (Gilson) со скоростью 3 мл / мин. В типичной 5-6 часа эксперимента, 1 л раствора Рингера каждого достаточно.
3. На протяжении эксперимента, ткани постоянно superfused с 37 ° С раствор Рингера. Нагревателя зонда находится прямо над ткани.
4. Стимулы поставляются использованием жидких Gilson 215 Обработчик робота-манипулятора. Стимулы хранятся в резиновых крышками стеклянных флаконах, и под контролем программного обеспечения Gilson, робота-манипулятора обеспечивает стимулы для перфузии линии, а постоянный расход и давление сохраняется.
5. Состояние ВЭЖХ клапан (цикл занимаются / не занимаются) представлен электрическое напряжение, которое регистрируется с помощью приобретения компьютера в качестве дополнительного канала для обеспечения синхронизации с нейронной активности.

Часть 3. Подготовка МЭС и Стимул Доставка устройства

1. Перед проведением вскрытия, заполните МЭС хорошо с BSA в dH2O, по крайней мере, 5 минут при комнатной температуре.
2. Промыть теплой MEA-пузырилась раствор Рингера и место МЭС на льду.
3. Премьер жидкости обработчик и ВЭЖХ насос в соответствии с инструкциями производителя.

Часть 4. VNO Dissection

1. Перед проведением вскрытия, заполнить 2 60x15 мм чашки Петри с пузырилась раствор Рингера и место на льду. Также заполнить 2 Sylgard покрытием чашки Петри, одного и того же размера с раствором Рингера и место на льду. Холод дополнительные 50 мл теплого-пузырилась Рингера для использования во время вскрытия.
2. Мышь приносится в жертву через CO ₂ удушья следует шейки дислокации.
3. Сделать двусторонних разрезы со стороны полости рта, параллельно линии челюсти, к задней части головы. Регистрация 2 разрезами вдоль задней части шеи и удалить спинной части головы, в результате чего нижняя челюсть придает мыши.
4. Использование тонких ножниц, вырезать между тканью и обе стороны верхней челюсти кость отделить ткани от костей.
5. Использование # 3 щипцы, шелушиться неба ткани подвергать носовой полости.
6. Используя небольшие ножницы или скальпель, разрез между и по обе стороны верхних 2 передних зуба, чтобы освободить вомероназального капсулы с костью.
7. Использование # 3 щипцы, забрать вомероназального капсулы плоские кости и поместить в чашку Петри на льду. Шагов вверх через погружение должно быть выполнено менее чем за 3 минуты.
8. Место блюдо под стереомикроскопа, освещенной отраженным светом. Удалить костлявые капсулу из одного ВНО в то время, с помощью # 3 щипцами. Одной рукой для стабилизации костной капсулы, удерживая его от хвостового конца и с другой стороны, кожура кости от ВНО, заботясь, чтобы не повредить ВНО.
9. Когда кости удалены, передача ВНО к Sylgard покрытием чашке Петри. Используйте оставшиеся блюдо для других ВНО. Переключатель освещения в проходящем свете.
10. Использование микро-ножницами или щипцами # 5, отдельные ВНО из кровеносных сосудов, сокращая по краю ВНО. В этот момент вы будетеесть нейронные лист полностью отделена от кровеносных сосудов.
11. Место ВНО с внутренними (дендритных) вверх. Использование # 3 щипцы, якорь ВНО к Sylgard на углу ткани. Пил нейронных эпителия от базальной пластинки с помощью небольшой фрагмент с тефлоновым покрытием лезвие бритвы, проведенных с зажимом. Холдинг лезвие под небольшим углом (<30 ° от поверхности посуды), тем лучше.
12. Использование стеклянной пипетки, передача части нейронной эпителий от блюдо МПС. Позиция ВНО на вершине электрода поле с дендритных стороной вверх. Удалить решение избыток Рингера с пипеткой. Место держатель сетки ткань в колодец массив для хранения ВНО на месте, и залейте охлажденным раствором Рингера.

Часть 5. Запись

1. Место МЭС в МЭС 1060 усилитель и положение нагревателя зонда непосредственно над ткани.
2. Для подтверждения правильного размещения датчика обогреватель, стимулируют раствором Рингера, содержащий 50 мМ калий (заменить эквимолярных натрия) в течение 2 секунд. Отрегулируйте расположение, чтобы минимизировать задержки нейронных ответ на калий решение.
3. Переливать ткани с раствором Рингера нагревают в течение 45 минут до 1 часа до записи, чтобы ткань, чтобы акклиматизироваться.
4. Электрические сигналы будут сохранены на диск при помощи специального программного обеспечения записи.

Часть 6. Анализ данных

1. Offline анализа данных можно сделать с помощью сырой записи электрода. Например, мы измеряем скорость возбуждения изменения записанных клетками в ответ на конкретные лигандами. В результате наборы данных велики и могут быть использованы для решения различных вопросов, знакомство с программированием или анализа языка (C, Matlab, R, Python или аналогичный) не требуется.

Часть 7. Представитель Результаты

Этот препарат, как правило, достаточно стабильны, чтобы записи с в течение 6 часов, что дает большой объем данных (6 часов записи от 60 электродов).

Рисунок 1. Снимок одновременной активности на одной половине массива показано на рисунке. Временное окно занимает 400 мс. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.

Рисунок 2. В типичном эксперименте, мы стимулируем с особым соединений, представляющих интерес в течение 10 секунд. Эта трасса является примером ответ на 100-кратном разбавленной мочи женщин мыши. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 2.

Discussion

Записи многоэлектродной массива позволяют нам способность контролировать одновременную активность большого числа нейронов. Это полезный инструмент для исследования свойств сенсорной системы, в частности, ВНО. В отличие от основной обонятельной системы, ВНО определяет стимулы в жидкой фазе. Кроме того, ВНО является гетерогенным ткани. Есть около 300 различных типов рецепторов у мышей ^1, предположительно, с различными профилями реакции. МЭС записи в сочетании с роботизированной руки позволяют нам надежно доставлять жидкости стимулов к большой и разнообразной популяции нейронов и идентичности ответ электрофизиологически. Кроме того, стабильность ВНО в пробирке дает время для нескольких повторов стимул.

Ранее этот метод был использован для исследования сенсорных свойств VSNs в ответ на мышь мочи ^2, а также служить в качестве надежного анализа для идентификации отдельных лигандов в моче ^3. В будущем этот метод может быть очень полезным дальнейшее открытие лиганда и для характеристики сенсорных свойств ВНО.