Vomeronasal Epitel Multielectrode Dizi Kayıtlar

Summary

Multielectrode array (MEA) kayıtları nöronların büyük nüfus elektriksel aktivite eğitimi için bir yöntem sağlar. Burada, aynı anda doku uyarıcı fare vomeronasal epitel kayıt MEA hazırlanması ayrıntılar mevcut.

Abstract

Sinir devreleri anlamak yöntemleri aynı anda birçok nöron kayıt gerektirir. Için

Protocol

Bölüm 1. Elektrik Kayıt Enstrümantasyon

1. Biz, silisyum nitrür ile yalıtılmış 10 mm düz titanyum nitrür elektrotlar düzlemsel multielectrode dizi (ALA Scientific Instruments) kullanın. 60 elektrotlar merkezi-merkezi, 30 mm boşluk ile bir 5x6 ızgara oluşan iki alan olarak düzenlenmiştir. (Diğer yapılandırmalar da mümkündür; elektrotlar ile 10 mm çapında bir kayıt yüzey izole tek nöronların aktivitesi açısından büyük elektrotlar daha iyi.)
2. Elektrik sinyalleri MEA 1060 amplifikatör (ALA Scientific Instruments) kullanılarak (1000x büyütme) güçlendirilir. Sinyaller bir veri toplama kartı (National Instruments) ve özel veri toplama yazılımı (bir de ticari yazılım satın alabilirsiniz) ile 10 kHz elde edilir.
3. Doku MEA kültür tüp halkasının içinde rahatça uyan özel bir eklemek için bağlı bir naylon mesh (53 mikron), MEA aşağı tutulur.

Bölüm 2. Sıvı Teslimat Enstrümantasyon

1. Doku Ringer solüsyonu (115 mM sodyum klorür, 5 mM potasyum klorür, 2 mM kalsiyum klorür, 2 mM magnezyum klorür, 25 mM sodyum bikarbonat, 10 mM HEPES ve 10 mM D-(+ sağlayarak garanti sürekli superfusion gerektirir HPLC pompası)-glikoz). Uyaranlar HPLC vana içine enjeksiyonlar ve akış yoluyla ve döngü arasında geçiş sunulmaktadır. HPLC pompası ve enjeksiyon robot şırınga pompası Ringer solüsyonu ile temin edilmektedir.
2. Zil çözümü deney boyunca 42 yaşında bir sıcak su banyosu (ISOTEMP 105) ° C'de muhafaza edilir ve sürekli olarak% 95 O ₂ /% 5 CO ₂ ile kabarmış. Glikoz olmadan Ringer ayrı bir şişesi, şırınga pompası yedeklemek için hazırlanmıştır. Ringer solüsyonu, 3 ml / dak hızında 307 HPLC pompası (Gilson) kullanarak doku teslim edilir. Tipik bir 5-6 saat deneyde, her Ringer solüsyonu 1 L yeterlidir.
3. Deney boyunca, doku sürekli olarak 37 ° C Ringer solüsyonu ile superfused. Isıtıcı prob, doğrudan doku üzerine yerleştirilmiş.
4. Uyaranlar Gilson 215 Sıvı Handler robot kolu kullanarak teslim edilir. Uyaranlar kauçuk kapaklı cam şişe içinde saklanır ve sabit akış hızı ve basınç korunur Gilson yazılım kontrolü altında, robotik kol perfüzyon hattına uyaranlara sunar.
5. HPLC vana (döngü meşgul / meşgul değil) nöronal aktivite ile senkronizasyon sağlamak için ekstra bir kanal olarak toplama bilgisayar tarafından kaydedilmiş bir elektrik gerilimi, devlet tarafından temsil edilmektedir.

Bölüm 3. MEA ve Stimulus Teslimat Cihaz Hazırlama

1. Diseksiyonu gerçekleştirmeden önce, oda sıcaklığında en az 5 dakika içinde BSA dH2O MEA ile doldurun.
2. Sıcak kabarmış Ringer çözeltisi kullanılarak MEA durulayın ve buz üzerinde MEA yerleştirin.
3. Başbakan sıvı işleyici ve HPLC üreticinin talimatlarına göre pompa.

Bölüm 4. VNO Diseksiyon

1. Diseksiyonu yapmadan önce, buz üzerinde kabarmış Ringer çözüm yeri ve 2 60x15 mm Petri kapları doldurun. Ayrıca buz üzerinde Zil çözümü ve yeri ile aynı boyutta 2 Sylgard kaplı Petri kapları doldurun. Diseksiyonu sırasında kullanmak için ek bir sıcak-kabarmış Ringer 50ml soğutun.
2. Fare servikal dislokasyon CO ₂ boğulma yoluyla kurban.
3. Başın arkasında, çene hattına paralel çalışan, ağız tarafında ikili kesiler olun. Boyun sırt boyunca 2 kesintileri katılın ve fare bağlı alt çene bırakarak, başın dorsal parçası kaldırın.
4. Ince makas kullanarak, doku ve kemik dokusu ayrı üst çene kemiğinin iki tarafında arasında kesti.
5. Nazal kavite maruz damak dokusu soyulabilir, # 3 forseps kullanarak.
6. Küçük bir makas veya kemik vomeronasal kapsül ücretsiz ve her iki tarafta üst 2 ön dişler arasında kesilmiş bir neşter, kullanma.
7. # 3 forseps kullanarak, buz üzerinde Petri kabındaki düz kemik ve yerine göre vomeronasal kapsül pick up. Daldırma yoluyla adımları en az 3 dakika içinde yapılmalıdır.
8. Yansıyan ışık ile aydınlatılmış bir stereomikroskop altında tabak yerleştirin. # 3 forseps kullanarak bir seferde, tek bir VNO kemik kapsül çıkarın. VNO kemik kabuğu, kuyruk ucu ve diğer taraftan sürükleyici VNO zarar vermemeye özen kemik kapsül stabilize etmek için tek bir elinizi kullanın.
9. Kemik kaldırıldığı zaman, bir Sylgard kaplı Petri kabı VNO aktarın. Diğer VNO kalan çanak kullanın. Iletilen ışık aydınlatma geçin.
10. Mikro-makas veya # 5 forseps kullanarak, kan damarı VNO VNO kenarından keserek ayırın. Bu noktadakan damarı tamamen ayrılmış nöral bir levha var.
11. VNO iç (dendritik) yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. # 3 forseps kullanarak, doku bir köşesinde Sylgard VNO çapa. Teflon kaplı jilet bir kelepçe ile yapılan küçük bir parçası kullanılarak bazal lamina sinir epiteli soyun. Sığ bir açı bıçak Holding (<30 ° çanak yüzeyinden) en iyisidir.
12. Cam bir pipet kullanarak, MEA, çanak sinirsel epitel parçası transfer. Dendritik yüzü VNO elektrot alanının üstüne yerleştirin. Aşırı Ringer solüsyonu bir pipet yardımıyla çıkarın. VNO bir yerde tutun ve soğuk Ringer solüsyonu ile doldurun dizinin kuyuya örgü doku tutucu yerleştirin.

Bölüm 5. Kayıt

1. MEA 1060 amplifikatör MEA doğrudan doku üzerine yerleştirin ve ısıtıcı prob pozisyonu.
2. Uygun ısıtıcı prob yerleştirme onaylamak için, Ringer solüsyonu 2 saniye için 50 mM potasyum (ekimolar sodyum yerine) içeren uyarır. Potasyum çözüm nöral yanıt gecikmeyi en aza indirmek için konumlandırma ayarlayın.
3. Doku gelmesini bekleyin kayıt önce 45 dakika ile 1 saat boyunca ısıtmalı Ringer solüsyonu ile doku Superfuse.
4. Elektrik sinyalleri özel kayıt yazılımı kullanarak diske kaydedilir.

Bölüm 6. Veri Analizi

1. Çevrimdışı veri analizi ham elektrot kayıtları kullanılarak yapılabilir. Örneğin, özellikle ligandlar tepki olarak kaydedilen hücrelerinin ateşleme hızı değişiklikleri ölçmek. Ortaya çıkan veri setleri büyük ve çok farklı soruları yanıtlamak için kullanılabilir; bir programlama veya analiz dili (C, Matlab, R, Python, ya da benzeri) aşinalık gereklidir.

Bölüm 7. Temsilcisi Sonuçlar

Bu preparat, genellikle yeteri kadar sabit verileri (60 elektrotlar 6 saat kayıt) büyük miktarda verimli, 6 saat boyunca kayıt.

Şekil 1: Bir anlık bir dizinin yarısı boyunca eş zamanlı aktivite gösterilmiştir . Zaman penceresi 400 ms kapsar. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız .

Şekil 2. Tipik bir deneyde, 10 saniye boyunca belirli ilgi bileşikleri ile uyarır. Bu eser 100 kat seyreltilmiş dişi fare idrar bir yanıt bir örnektir. Lütfen Şekil 2'de büyük halini görmek için buraya tıklayın .

Discussion

Multielectrode dizi kayıtları bize büyük bir nüfusun nöronların eş zamanlı etkinliğini izlemek için izin verir. Bu, özellikle VNO bir duyu sistemi özellikleri problama için yararlı bir araçtır. Ana koku alma sisteminin aksine, VNO sıvı faz uyaranlara algılar. Buna ek olarak, VNO heterojen bir dokudur. Muhtemelen farklı tepki profilleri fare ¹ reseptörlerinin yaklaşık 300 farklı türleri vardır. Robotik kol ile birlikte MEA kayıtları bize, güvenilir, nöronlar ve elektrofizyolojik kimliğini bir yanıt geniş ve çeşitli bir nüfus sıvı uyaranlara teslim izin verir. Buna ek olarak, in vitro VNO istikrarı bir uyarıcı birden fazla tekrarlar için zaman sağlar.

Daha önce, bu tekniğin yanı sıra idrar ³ bireysel ligandlar belirlemek için güvenilir bir tahlil olarak hizmet ettiği ² fare idrar yanıt VSNs duyusal özelliklerini araştırmak için kullanılır olmuştur. Gelecekte, bu teknik, çok daha fazla ligand keşif yararlı ve VNO duyusal özelliklerini karakterize olabilir.