ניתוח התגובות של נוירונים עכבר חוש הריח חושי באמצעות הקלטה אוויר שלב Electroolfactogram

Summary

ההקלטה (EOG) electroolfactogram היא דרך אינפורמטיבי, קל לנהל, אמין להערכת תפקוד הריח ברמה של אפיתל הריח. פרוטוקול זה מתאר הגדרת הקלטה, רקמות העכבר הכנה, איסוף נתונים, ניתוח נתונים בסיסיים.

Abstract

בעלי חיים תלויים olfaction להתנהגויות קריטיים רבים, כמו מציאת מקורות מזון, הימנעות מטורפים, וזיהוי conspecifics עבור הזדווגות ואינטראקציות חברתיות אחרות. ההקלטה (EOG) electroolfactogram היא שיטה אינפורמטיבי, קל לנהל, ואמין לתפקד assay הריח ברמה של אפיתל הריח. מאז 1956 תיאור של EOG על ידי Ottoson ב צפרדעים ^1, ההקלטה EOG יושם חוליות רבים, כולל סלמנדרות, ארנבות, חולדות, עכברים ובני אדם (נבדקה על ידי סקוט סקוט ג'ונסון, 2002, נ"צ. 2). ההתקדמות שינוי גנטי בעכברים לעורר עניין מחדש ההקלטה EOG לאפיון פיזיולוגיים של תפקוד חוש הריח של עקום החוצה עקום בעכברים. הקלטות EOG יושמו בהצלחה כדי להדגים את התפקיד המרכזי של חוש הריח התמרה רכיבים אות ^3-8, ולאחרונה לאפיין את התרומה של מנגנוני ויסות מסוים לתגובות OSN ^9-12.

איתור odorant מתרחשת על פני השטח של האפיתל על חוש הריח cilia של OSNs, שם מפל הולכת אותות מוביל הפתיחה של תעלות יונים, יצירת זרם זורם לתוך cilia ו depolarizes הממברנה ^13. EOG הוא פוטנציאל שלילי נרשם extracellularly על גירוי odorant על ​​פני השטח של האפיתל חוש הריח, הנובע סיכום של שינויים אפשריים שנגרמו OSNs תגובה הפרט בתחום הקלטה ^2. השוואה של משרעת ו קינטיקה של EOG ובכך לספק מידע חשוב על איך הנדסה גנטית ומניפולציות ניסיוניים אחרים להשפיע על איתות המולקולריים שבבסיס התגובה OSN לריח.

כאן אנו מתארים הקלטה אוויר EOG על שלב ההכנה של turbinates עכבר חוש הריח. בקצרה, לאחר להקריב את העכבר, turbinates חוש הריח נחשפים על ידי שחצתה את הראש לאורך קו האמצע והסרת מחצה. הכנה חלזוני ממוקם אז הגדרת הקלטה, אלקטרודה ההקלטה ממוקם על פני השטח של האפיתל חוש הריח על אחד turbinates המדיאלי. אלקטרודה הפניה מחובר חשמלית לרקמה באמצעות פתרון חיץ. זרם מתמיד של אוויר humidified הוא פוצץ על פני השטח של האפיתל כדי לשמור אותו לח. אדי פתרונות odorant הוא ניפח לתוך זרם של אוויר humidified כדי לעורר את האפיתל. התגובות מוקלטים דיגיטציה לניתוח נוסף.

Protocol

חלק 1. הגדרת הקלטה EOG

מנגנון הקלטה מורכב אלקטרודה הקלטה, אלקטרודה השוואתית, משלוח צינור אוויר, שלב הדגימה, ואת מיקרוסקופ לנתח, כל מעוגן על שולחן האוויר בתוך כלוב פאראדיי. Micromanipulators משמשים מיקום האלקטרודות ואת צינור אספקת האוויר. זרם אוויר רציפה הוא מבעבע דרך מים מזוקקים כדי להוסיף לחות לפני עובר דרך צינור אספקת האוויר על הדגימה. צלחת תרבות 60 מ"מ מלא Sylgard עד לעומק של 6-8 מ"מ משמש כמשטח הרכבה הדגימה. גם ותעלה הם חלולים מתוך Sylgard בצלחת גובר לספק אמצעי לחבר את אלקטרודה חשמלית התייחסות הדגימה באמצעות פתרון שונה רינגר.

אלקטרודה הקלטה האלקטרודה התייחסות מחוברים למגבר. אותות מן המגבר נשלחים digitizer, ולאחר מכן למחשב. תוכנות כגון Axograph או pClamp יכול לשמש כדי לשלוט על פרוטוקול גירוי, כדי להקליט את האות, עבור ניתוח בדיעבד של התגובות. אוסצילוסקופ מחובר אחרי המגבר יכול להיות נוח עבור ניטור בזמן אמת של הפוטנציאל החשמלי תוך הצבת אלקטרודה הקלטה במהלך ההקלטות EOG.

מסירה של גירויים odorant נשלטת על ידי Picospritzer, אשר מחובר לאותו מחשב המשמש לרכישת אות. לחץ האוויר בכל Picospritzer מוגדר 10 psi. טנק באוויר הרגולטור יחיד יכול לשמש כדי לספק אוויר לשולחן הן האוויר Picospritzer. טנק באוויר הרגולטור השני משמש כדי לספק אוויר זרם האוויר humidified, כמו זה דורש לחץ נמוך כמות גדולה של זרימת האוויר. רק לפני מתן תמריץ odorant, הפלט Picospritzer מחובר בקבוק odorant. הבקבוק odorant מחובר אז צינור אספקת האוויר.

חלק 2: הכנת אלקטרודות

אלקטרודה ההקלטה חוט כסף chlorided בכוס משך נימי מלאים פתרון שונה של רינגר (135 mM NaCl, KCl 5 mM, 1 mM CaCl _2, 1.5 מ"מ MgCl _2, 10 HEPES מ"מ, pH 7.4, מסנן מעוקרים). אלקטרודה השוואתית הוא חוט כסף chlorided.

1. התקן חוט כסף לתוך מחזיק האלקטרודה. עבור האלקטרודה הקלטה, 1-2 ס"מ של חוט צריך לבלוט מהקצה של מחזיק האלקטרודה. חוט נוסף ניתן עזב האלקטרודה התייחסות.
2. כדי להוסיף את המעיל AgCl על חוט כסף, מקם את חוט 0.1 M NaCl ולחבר את מחזיק האלקטרודה להדק החיובי של מקור מתח DC 1.5-9 וולט. הטרמינל השלילי של מקור הכוח צריך להיות מחובר חשמלית של פתרון 0.1 M NaCl. אפשר התגובה chloriding להמשיך במשך 10 דקות. כדי להשוות כל מטען סטטי בין ההקלטה לבין אלקטרודה השוואתית, לגעת בקצרה את האלקטרודות יחד לפני להתקין אותם במכשיר ההקלטה.
3. משוך זכוכית נימי באמצעות חולץ micropipette. פתיחת בקצה של נימי צריך להיות סביב 5-10 מיקרון קוטר.
4. השתמש עיפרון יהלום להבקיע ולשבור את הקצה הקהה של נימי כך ~ 2 ס"מ יותר מאשר חוט כסף. Fire-ללטש את הקצוות עם הלפיד בוטאן.
5. ממיסים agarose 0.5% בפתרון שונה רינגר. משוך כמות קטנה של פתרון agarose מותכת לתוך קצה האלקטרודה בעזרת פיפטה ההעברה.
6. מלאו את נימי משך כ 1 / 2 הדרך עם פתרון שונה של רינגר (מזרק כי כבר מחומם ומשך יש סוף דק וארוך הוא שימושי לצורך זה). בעדינות קפיצי נימי כדי לסלק בועות אוויר. אחסן את האלקטרודה מלא בצנצנת אחסון עם כמות קטנה של פתרון שונה רינגר בתחתית עד שהם מוכנים לשמש. לאחר דגימת רקמה ערוכה ומוכנה הקלטה, להתקין נימי מלא על חוט האלקטרודה ההקלטה.

חלק 3: פתרונות odorant הכנת

אצטט odorants amyl ו heptaldehyde לעורר תגובות גדולים הם בחירה טובה וכך גם ממריצים EOG.

1. ב צינורות microcentrifuge, להכין סדרה של דילולים של odorant ב sulfoxide דימתיל (DMSO). כנקודת התחלה עבור עקומת מנה תגובה, להכין פי 10 דילולים מ M 5-5 x 10 ^-6 מ ' הפוך את דילולים טרי בכל יום.
2. יתר על כן לדלל את odorants של פי 50 על ידי ערבוב מים 100 מניות בדילול μL ב DMSO עם מים MLS 4.9 ב 2 בקבוקים עם פקקים לאונקיה סיליקון. בואו הפתרונות לאזן בבקבוקים למשך 30 דקות לפחות. שים לב כי ריכוז אדי של odorants בבקבוק אחד אינו ידוע, אך עשוי להשתנות כפונקציה של ריכוז odorants בשלב נוזלי.
3. להוסיף שני 18-מד מחטים באמצעות פקק סיליקון provide קלט פלט יציאות. יציאות צריך להיות מחובר לחשמל כאשר הבקבוק לא בשימוש.

חלק 4: הקלטה וניתוח נתונים EOG

1. הקורבן עכבר ידי המתת חסד CO ₂ או הרדמה יתר בעקבות עריפת ראש. הסר את העור שמעל הגולגולת sagittally לחצות את הראש לאורך קו האמצע.
2. הר מחצית הראש, בצד המדיאלי למעלה, על צלחת גובר. הסר בזהירות את מחצה לחשוף את turbinates.
3. מניחים את צלחת עם רקמה רכוב על הבמה את ההקלטה. יישר את הבמה כל כך את המיקום ההקלטה turbinates הוא מרוכז תחת המיקרוסקופ.
4. הפעל את הטנק באוויר כדי לספק אוויר humidified אל פני השטח חלזוני. מיקום צינור אספקת האוויר, כך הוא כ 10 מ"מ מן המיקום ההקלטה. קצב הזרימה הוא ~ 600 mL / min.
5. הגדר את המגבר על מצב DC (הגברה AC יניעו חפצים האות EOG) עם פילטר נמוך לעבור על kHz 1, ולהשיג על 100x.
6. הר הקלטה אלקטרודות התייחסות על micromanipulators.
7. מנמיכים את האלקטרודה התייחסות אל תוך הבאר על צלחת הרכבה ומכסים פתרון כזה הוא מחובר חשמלית לרקמה שונה רינגר.
8. בזהירות להוריד את האלקטרודה הקלטה על פני השטח של חלזוני IIb או השלישי. האלקטרודה צריכה כמעט לגעת במשטח של אפיתל הריח! כאשר האלקטרודה בא במגע עם האפיתל (כלומר משלים מעגל חשמלי) בסיסית ישר יופיע האוסילוסקופ.
9. צרף בקבוק odorant לנמל בצד על צינור אספקת האוויר.
10. במחשב, ליזום פרוטוקול גירוי. קצב הדגימה לרכישת נתונים צריך להיות 2 קילוהרץ ומעלה. התוכנה תפעיל את הדופק ריח להתחיל את ההקלטה.
11. פרוטוקול גירוי אופייני יכול להיות דופק 100 msec משך אחת, יחד 100 msec פולסים מופרדים על ידי רווח 1 שניות, או 10 שניות הדופק מתמשכת.
12. אפשר קצת זמן בין פרוטוקולי כך את רקמת מותאם מינימלית. רגע אחד הוא די ריכוזי נוזלי של אצטט amyl ו heptaldehyde עד 10 מ ^-3: בריכוזים גבוהים לאפשר 5 דקות. לאחר מתן ריח בריכוזים גבוהים (כמו בסוף של עקומת מנה תגובה) ריח שיורית עשויים להישאר בצינור. לשטוף את צינור האוויר עם אתנול 95% ויבש לפני שתמשיך עם דגימות רקמה נוספות.
13. Axograph התוכנה מספקת כלים למדידת פרמטרים מרכזיים של האות EOG. פרמטרים אלה כוללים את המשרעת בתגובה, חביון, זמן שיא, וקבועים זמן של סיום. זה יכול להיות רצוי דיגיטלית לסנן עקבות ב 25 הרץ לפני ניתוח נוסף.

נציג תוצאות

באיור 1. פרמטרים עבור EOG ניתוח. פרמטרים כמה EOG הם שימושיים במיוחד עבור השוואה של תגובות בין עכברים, לרבות משרעת בתגובה, חביון (הזמן בין הגירוי כאשר ניתנת ותגובה מתחיל), עלייה (הזמן בין תחילת התגובה ואת שיא), זמן שיא (הזמן מתחילת הגירוי לשיא של התגובה), וזמן קבוע סיום (τ, נקבע על ידי התאמת שלב הדעיכה של התגובה משוואה מעריכית יחיד ). לשם השוואה של פרמטרים קינטיים כגון חביון, זמן העלייה, זמן קבוע של סיום, רצוי לנרמל את המשרעת שיא של תגובות לפני ניתוח.

איור 2. נציג EOG אותות תחת פרוטוקולים גירוי שונים. (א) דוגמאות EOGs מתוך עכבר בתגובה לגירוי עם ריכוז גדל והולך של אצטט amyl. קו שחור בחלק העליון של הלוח מציין את העיתוי וזמן הגירוי odorant. הריכוזים במקרא הם ריכוזים של הפתרון נוזלי. (ב) ביחס מנה תגובה ממוצע של חמישה עכברים. ברים שגיאה הם רווחי סמך 95%. ירידה משרעת השיא הוא נצפה לעיתים קרובות ריח בריכוזים גבוהים מאוד. (ג) דוגמה EOG בתגובה לגירוי לזווג-דופק. הדופק קצר אחד של odorant מעורר הסתגלות שנמשך כמה שניות. (ד) דוגמה EOG בתגובה 10-sec גירוי מתמשך odorant. EOG מראה הפחתת רגישות במהלך המצגת odorant רציפה.

Discussion

עם ההתקנה המתואר בפרוטוקול זה, גירויים odorant על פני השטח של האפיתל הריח יהיה עקבי בין ההכנות רקמות, המאפשרות השוואה בין סוג בר עכברים שעברו מוטציה, למרות ריכוז odorant המדויק ואת הדינמיקה אינם ידועים. מספר גורמים, במיוחד את המיקום להקליט את קצב הזרימה של האוויר humidified, לגרום לשינויים EOG. יש להקפיד לרשום מעמדות דומה על חלזוני אותו כדי למזער וריאציה. זה יכול בקלות להיות מושגת על ידי בעקביות הקלטה מאותו צד של הראש ולשמור את טביעת הרגל של המיקרוסקופ, משלוח צינור ריח, ואת micromanipulators על שולחן האוויר ללא שינוי בין דגימות רקמה. בנוסף, דגימות רקמה יש להציב מיד לתוך זרם אוויר humidified לאחר לנתיחה כדי למנוע ייבוש יתר של הרקמה.

הקלטות EOG על עכברים יכולים גם להתבצע עם מנגנון זלוף נוזלי על העכבר מוכן turbinates ^{7, 14, 15,} או על ידי השארת ראש שלם החדרת אלקטרודה לתוך קדח חור קטן מעל turbinates ^{16, 17.} כל וריאציה של הקלטה EOG יש עוצמות משלה: אוויר שלב ההקלטות על ההכנות רקמות כמתואר בפרוטוקול זה דורשת כמות מזערית של ההתקנה הם הקלים ביותר לנהל, הקלטות באמצעות מנגנון זלוף נוזלי להקל על השימוש ריאגנטים תרופתי, למרות אופי הידרופובי של odorants רבים מסבך משלוח ריח, ולבסוף, הקלטות שבהן ראש נותר בשלמותו ניתן להשתמש ב 'מלאכותי לרחרח "ניסויים, למרות מיקום האלקטרודה קשה יותר כאשר turbinates נחשפים במלואם.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Air delivery tube	equipment	Custom Made		The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute
Air table	equipment	Newport Corp.	LW3030B-OPT
Amplifier	equipment	Warner Instruments	DP-301
Computer and Data Acquisition Software	equipment	Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh		Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/.
Butane torch	equipment			A crème brûlèe torch works well
Digitizer	equipment	Axon Instruments	Digidata 1322A
Dissecting Scope	equipment	Scienscope	SSZ
Electrode holder	equipment	Harvard Apparatus	64-1021
Magnetic Holding Devices (12 mm)	equipment	World Precision Instruments, Inc.	M10
Micromanipulators	equipment	World Precision Instruments, Inc.	M3301R M3301L
Micropipette Puller	equipment	Sutter Instrument Co.	P2000
Oscilloscope	equipment	Tektronix, Inc.	5110
Picospritzer III	equipment	Parker Hannifin Corporation
Silicone tubing	equipment	Nalge Nunc international
Specimen stage	equipment	Custom Made		Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay.
18 gage needles	material	BD Biosciences	305195
2 oz. glass bottles	material	VWR international	16152-201
Glass capillaries	material	World Precision Instruments, Inc.	TW150F-6
Silicone stoppers size 16D	material	Chemware	D1069809
Silver wire	material	World Precision Instruments, Inc.	AGW1010
SylGuard 184	material	Dow Corning	SYLG184	From World Precision Instruments
Agarose	reagent	Invitrogen	15510-027
Amyl acetate	reagent	Aldrich	W504009
Calcium chloride (CaCl2)	reagent	Sigma-Aldrich	C-1016
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	reagent	Sigma-Aldrich	D5879
HEPES	reagent	Fisher Scientific	BP310
Heptaldehyde	reagent	Aldrich	H2120
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O)	reagent	Sigma-Aldrich	M9272
Sodium chloride (NaCl)	reagent	JT Baker	3624-05
flowmeter	equipment	Gilmont Instruments	GF-2260