Summary
Bu video in vitro anjiyogenez tayininde bir protokol anjiyogenez özetlediği çeşitli aşamaları olduğunu göstermektedir. Zaman atlamalı çimlenme görüntüleri, lümen oluşumu, dallanma ve anastomoz - anjiyogenez temel özellikleri gösterilmektedir.
Abstract
Anjiyogenez anjiyogenik uyaranlara yanıt olarak, yeni damarlar mevcut damarsal oluşturulan karmaşık çoklu adımlı bir süreçtir. Bu adımlar şunlardır: ekstrasellüler matriks, kablosuna AT uyum içine endotel hücreleri bazal membran, proliferasyon ve göç (çimlenme) (EC) bozulması, dallanma, lümen oluşumu, anastomoz, ve yeni bir bazal membran oluşumu. In vitro tayinlerde, bu süreç pek çok çalışma için geliştirilmiş, ancak çoğu sadece belirli aşamalarında anjiyogenez taklit ve morfolojik testlerin içinde gemilerin çoğu in vivo gemileri benzemez edilmiştir. Nehls ve Drenckhahn tarafından daha önceki çalışmaları üzerine dayanarak, insan umbilikal ven EC ve fibroblastlar kullanır in vitro anjiyogenez tayininde bir iyimserlik var. Bu model özetlediği anjiyogenez en önemli erken aşamalarında ve daha da önemlisi, gemilerin polarize Avrupa Komisyonu tarafından çevrili patent hücrelerarası lümen gösterilecek. EC cytodex microcarriers üzerine kaplanmış ve fibrin jel içine gömülü. Fibroblastlar EC boncuk yüzeyinden çimlenme teşvik gerekli çözünür faktörlerin sağlayan jel üstünde katmanlı. Birkaç gün sonra, çok sayıda gemiler, faz-kontrast ve zaman atlamalı mikroskobu altında kolayca gözlenebilir olduğunu mevcut. Bu video bu kültürlerin kurulmasında önemli adımlar gösteriyor.
Protocol
HAZIRLAMA HÜCRELERİ
- FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 gün boncuk önce M199/10% HUVEC ve fibroblastlar getirin.
- Fibroblastlar için gömmeden önce HUVEC ve gün için boncuk önce EGM-2 (Clonetics) gün orta açın.
- ~ 400 HUVEC başına boncuk bir konsantrasyon gereklidir.
- Ortalama 20.000 fibroblastlar ihtiyaç vardır.
HUVEC İLE BONCUK KAPLAMA - GÜN -1
- HUVEC Trypsinize.
- Boncuk (SANTRİFÜJ VERMEYİN!) Yerleşmek için izin ver. Süpernatantı aspire ve 1 ml sıcak EGM-2 orta boy boncuklar kısaca yıkayın.
- FACS tüp sıcak EGM-2 orta boy 1.5 mL Mix 2500 boncuk w / 1x10 6 HUVEC. Inkübatör dikey olarak yerleştirin. (Gerekirse ~ 10 kuyu. Ölçeği için yeterli olacaktır)
- Tüp sallayarak her 20 dakikada, 37 ° C'de 4 saat inkübe edin. (İyi kaplama filizlenmesi için çok önemlidir.)
- 4 saat sonra, T25 EGM-2, 5 ml'lik bir balona kaplı boncuklar transfer ve O / N terk
Fibrin GEL 'IN KAPLI BONCUK Katıştırma GÜN 0 -
- 2.0 mg / ml fibrinojen solüsyonu (tarifi bölümüne bakınız) hazırlayın.
- 0.15 Birimler / ml aprotinin fibrinojen solüsyonu ekleyin.
- 15 mL konik bir tüp kaplı boncuk boncuk transferi ve yerleşmek. EGM-2 1 ml ve 1.5mL bir santrifüj tüpüne transfer süspanse edin boncuk.
- YAVAŞÇA yukarı ve aşağı pipeting EGM-2 1mL 3X boncuk yıkayın.
- Bir lamel tespih ve ~ 500 boncuk / ml 'lik bir konsantrasyon fibrinojen solüsyonu tekrar süspansiyon haline getirin.
- Her bir kuyu için 0.625 ünite / ml trombin ekleyin.
- 24 plaka her bir kuyu için 0.5 mL fibrinojen / boncuk süspansiyonu ekleyin.
Her bir kuyu için pipet ! - Trombin ve fibrinojen pipet ucu ile yaklaşık 4 - 5 kez yavaşça aşağı yukarı gidiyor ve karıştırın. Büyük baloncuklar yapmak için dikkatli olun.
- Kaputu 5 dakika plaka bırakın, sonra bir pıhtı oluşturmak için 10-15 dakika süreyle 37 ° C-inkübatör yerleştirin.
- Pıhtı beklerken, fibroblastlar trypsinize.
- 1 EGM-2 mL başına damla damla ekleyin.
- Ortalama 20.000 hücre bir konsantrasyon fibrin jel üstünde Tohum fibroblastlar.
NOTLAR:
Genellikle, fibrin jel oluşur, jel küçük kabarcıklar göreceksiniz. Merak etmeyin, bunlar 3-4 gün içinde kaybolur.
, Her gün, yani Gün 2, 4, 6, vb ortam ..
Günde 3 veya 4 ile çimlenme başlamalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
, In vitro anjiyogenez deneylerde üç boyutlu (3D) 2D kültürleri kullanılarak elde edilebilir in vivo daha gerçek bir ortamda daha yakın bir model sunuyoruz artan bir fikir birliği yoktur. Bu üstün 3D sistemleri tekrarlanabilir ve anjiyogenez önemli adımlar birkaç taklit etmek mümkün gerektiği açıktır. Önceki birkaç 3D testleri geliştirilmiş olsa da, bunların pek çoğu ya mikrovasküler hücreleri elde etmek için zor kullanmak, ya da sadece bazı aşamaları özetlemek. Bu video, açıklamak ve vasküler araştırma ve kolayca elde edilebilen ve en sık kullanılan AT insan umbilikal ven EC kullanır in vitro anjiyogenez tayininde optimize gerçekleştirme. Testi, birkaç gün boyunca, sürekli olarak polarize Avrupa Komisyonu tarafından çevrili açık, patent hücrelerarası lümen uzun damarları çoğalır. AT damarların dallanma ve füzyon (anastomoz) Daha sonraki aşamalarda da görülmektedir. Önemlisi, bu kültürlerin HUVEC çimlenme, göç, hizalama, proliferasyon, tüp oluşumu, dallanma ve anastomoz da dahil olmak üzere, in vivo veya in vitro olarak, tüm mikrovasküler EC görülen morfolojik değişiklikler uğrarlar. HUVEC değişikliklere paralel olarak, gen ekspresyon profili daha yakından mikrovasküler AT maç. Sonuç olarak, in vitro anjiyogenez modelinde bir optimize edilmiş bir protokol mevcut ki bu süreci özetlediği birkaç önemli aşamaları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex-3 Beads | Reagent | Amersham | 17-0485-01 | 10 g/bottle. 1.0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH = 7.4) for at least 3 h at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker.2.Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).3.Discard the PBS and replace with fresh PBS:25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/ mL4.Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).5.Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115°C.6.Store it at 4°C. |
| Aprotinin | Reagent | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10 mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20 °C. |
| Fibrinogen Type I | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1 g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBSNote clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37 °C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.Sterile filter through 0.22 um |
| Thrombin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg = 1,000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20 °C. |
References
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
