Summary
이 동영상은 체외의 angiogenesis 분석에의 프로토콜을 보여줍니다 angiogenesis의 recapitulates 여러 단계의 것을. 시간 저속 돋아의 이미지, 루멘 형성, 분기 및 문합 - angiogenesis의 주요 기능은 - 표시됩니다.
Abstract
Angiogenesis는 angiogenic 자극에 대응, 새로운 선박은 기존 vasculature에서 만들어지는 복잡한 다단계 프로세스입니다. 이러한 단계는 다음과 같습니다 세포외 기질, 코드로 EC의 정렬에 내피 세포의 지하 막, 증식 및 마이 그 레이션 (돋아) (EC)의 저하, 분기, 루멘 형성, 문합, 새로운 지하 막 형성합니다. 시험 관내 assays의 많은이 과정을 연구하기 위해 개발하지만, 대부분의 전용 angiogenesis의 특정 단계를 모방하고, morphologically assays 내에 혈관이 자주 생체내에서 선박과 유사하지되었습니다. Nehls 및 Drenckhahn로 이전 작업을 바탕으로, 우리는 인간 제대 정맥 EC와 섬유아 세포를 이용 체외의 angiogenesis 분석에 최적화했습니다. 이 모델 recapitulates는 angiogenesis의 핵심 초기 단계의 모든하고, 중요한 혈관 편광 EC 둘러싸인 세포 특허 루멘을 표시합니다. EC는 cytodex의 microcarriers에 코팅 및 섬유소 젤에 포함됩니다. 섬유아 세포들은 EC의 구슬의 표면에서 돋아 촉진 필요한 가용성 요소를 제공하는 젤 위에 계층입니다. 며칠 후, 수많은 혈관은 쉽게 위상 대조 및 시간 경과 현미경 하에서 관찰 수있는 선물입니다. 이 동영상이 문화를 설정의 주요 단계를 보여줍니다.
Protocol
준비 CELLS
- FBS / 펜 - Strep (1:100) 1~2일 구슬선 전에 M199/10 %에 HUVEC와 섬유아 세포를 가져와.
- 섬유아 세포에 대한 퍼가기 전에 HUVEC와 하루 구슬 장식하기 전에 EGM - 2 (Clonetics) 하루 매체를 전환합니다.
- ~ 400 HUVEC 당 비드의 농도가 필요합니다.
- 물론 당 20,000 섬유아 세포이 필요합니다.
HUVEC있는 비즈 코팅 - DAY -1
- HUVEC을 Trypsinize.
- (원심 분리기하지 마십시오!) 정착 구슬을 허용합니다. 뜨는을 대기음 따뜻한 EGM - 2 배지 1 ML에 간단히 비즈 씻으십시오.
- 외과 튜브에 따뜻한 EGM - 2 배지의 1.5 ML에 혼합 2,500 구슬 w / 1X10 6 HUVEC. 인큐베이터에 수직으로 그것을 놓으십시오. (필요한 경우 ~ 10 우물가. 최대 규모 이것만으로도 충분하다)
- 관 매 20 분 흔들어, 37 ° C에서 4 시간 동안은 부화. (좋은 코팅 돋아 중요합니다.)
- 사시간 후, EGM - 2의 5mL의 T25 플라스크에 코팅 구슬을 전송 및 O / N.를 떠나
DAY 0 - 섬유소 젤 IN 코팅 구슬을 포함
- 2.0 MG / ML 피브리노겐 솔루션 (조리법 섹션을 참조하십시오) 준비합니다.
- 피브리노겐 솔루션 0.15 단위 / aprotinin의 ML을 추가합니다.
- 15mL 원뿔 관에 코팅 구슬을 전송하고 구슬 좀 쉬라 구. EGM - 2의 1mL와 1.5mL 원심 튜브로 전송에 Resuspend 구슬.
- 천천히 위아래 pipeting하여 EGM - 2의 1mL와 배 비즈 씻으십시오.
- coverslip에 구슬을 카운트하고 ~ 500 구슬 / ML의 농도에서 피브리노겐 용액에 resuspend.
- 각 잘하는 0.625 단위 / 트롬빈의 ML을 추가합니다.
- 24 - 잘 접시의 각각 잘 수있는 피브리노겐 / 비드 정지의 0.5 ML를 추가합니다.
각 잘 대해 피펫 팁을 변경합니다! - 피펫 팁로 가볍게 ~ 4-5 번 아래로 가서 의해 트롬빈과 섬유소를 섞는다. 큰 거품을하지 않도록주의하십시오.
- 후드 5 분 접시를 남겨, 다음 응고를 생성하기 위해 10-15 분 37 ° C - 배양기에 놓으십시오.
- 응고를 기다리는 동안, 섬유아 세포를 trypsinize.
- 1 EGM - 2의 ML 당 잘 현명한 드롭을 추가합니다.
- 물론 당 20,000 세포의 농도에서 섬유소 젤 위에 시드 섬유아 세포.
참고 :
일반적으로 섬유소 젤이 형성되면, 당신은 겔에 작은 거품을 볼 수 있습니다. 걱정하지 마세요, 그들은 3-4 일 내에 사라집니다.
다른 모든 일 즉, 일 2, 4, 6, 등 미디어를 변경 ...
3 일 또는 4에 의해 당신이 돋아보고 시작합니다.
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Discussion
시험 관내 angiogenesis의 assays에서 (3D) 입체은 2D 문화를 사용하여 얻을 수있는 것보다 생체내의 실제 환경에 훨씬 가까운 모델을 제공 강력히 주장하고있다. 그것은 우수한 3D 시스템은 재현성 수 있으며, angiogenesis의 주요 단계의 몇몇을 모방 수있을 것이 분명합니다. 몇 가지 이전 3D assays가 개발되었습니다 있지만, 이러한 많은도 microvascular 세포를 얻기 위해 열심히 사용, 아니면 단계의 일부를 요점을 되풀이하다. 이 비디오에서는, 우리는 설명하고 혈관 연구에 쉽게 얻을 수 있고 가장 일반적으로 사용되는 EC 인간의 배꼽 정맥 EC를 이용 체외의 angiogenesis 분석의 최적화를 수행합니다. 분석은, 며칠의 과정을 통해, 지속적으로 편광 EC 둘러싸인 명확 특허 세포 루멘 긴 선박을 재현. 선박의 EC 분기와 퓨전 (문합)의 나중 단계도 관찰됩니다. 중요한 것은,이 문화의 HUVEC이 돋아, 마이 그 레이션, 정렬, 확산, 튜브 형성, 분기 및 문합 포함하여 생체내이나 체외에서 중, microvascular EC와 함께 볼 수있는 형태학의 모든 변경 사항을 받다. 에 병렬로 HUVEC 변화의 유전자 발현 프로파일 더 밀접하게 microvascular EC의 일치합니다. 결론적으로, 우리는 체외의 angiogenesis 모델에 대한 최적화된 프로토콜을 제시 것이이 과정의 recapitulates 몇 가지 중요한 단계.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex-3 Beads | Reagent | Amersham | 17-0485-01 | 10 g/bottle. 1.0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH = 7.4) for at least 3 h at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker.2.Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).3.Discard the PBS and replace with fresh PBS:25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/ mL4.Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).5.Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115°C.6.Store it at 4°C. |
| Aprotinin | Reagent | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10 mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20 °C. |
| Fibrinogen Type I | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1 g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBSNote clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37 °C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.Sterile filter through 0.22 um |
| Thrombin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg = 1,000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20 °C. |
References
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
