Summary
Este video muestra el protocolo de un ensayo de angiogénesis in vitro que recapitula varias etapas de la angiogénesis. Time-lapse imágenes de germinación, la formación del lumen, ramas y anastomosis - las características clave de la angiogénesis - se muestran.
Abstract
La angiogénesis es un complejo proceso de múltiples pasos, donde, en respuesta a estímulos angiogénicos, nuevos vasos son creados a partir de los vasos existentes. Estas medidas incluyen: la degradación de la membrana basal, proliferación y migración (brotes) de las células endoteliales (CE) en la matriz extracelular, la alineación de la CE en los cables, ramas, la formación del lumen, anastomosis y la formación de una nueva membrana basal. Muchos de los ensayos in vitro se han desarrollado para estudiar este proceso, pero la mayoría sólo imitar ciertas etapas de la angiogénesis, y morfológicamente los vasos en los ensayos a menudo no se parecen a los barcos en vivo. Basado en un trabajo anterior de Niels y Drenckhahn, hemos optimizado un ensayo de angiogénesis in vitro, que utiliza la vena umbilical humana CE y los fibroblastos. Este modelo recapitula todas las etapas clave al comienzo de la angiogénesis y, sobre todo, los vasos pantalla patente lúmenes intercelular rodeado de polarización CE. CE se aplica sobre microportadores cytodex y embebido en un gel de fibrina. Los fibroblastos son en capas en la parte superior del gel donde se presten los necesarios factores solubles que promueven la CE que brotan de la superficie de los granos. Después de varios días, numerosos vasos que están presentes se puede observar fácilmente en contraste de fases y microscopía lapso de tiempo. Este video muestra los pasos clave en la creación de estas culturas.
Protocol
CÉLULAS PREPARACIÓN
- Abrir HUVEC y fibroblastos en M199/10% de SFB / Pen-estreptococo (1:100) 1-2 días antes de abalorios.
- Interruptor de medio EGM-2 (Clonetics) el día antes de abalorios para HUVEC y el día antes de la incrustación de los fibroblastos.
- Una concentración de aproximadamente 400 bolas por HUVEC es necesario.
- 20.000 fibroblastos por bien que se necesita.
RECUBRIMIENTO las cuentas con HUVEC - día -1
- Trypsinize HUVEC.
- Permitir cuentas para resolver (NO CENTRIFUGA!). Aspirar el sobrenadante y lavar las cuentas brevemente en 1 ml de agua tibia EGM-2 medio.
- Mix cuentas 2500 w / 1X10 6 HUVEC en 1,5 ml de agua tibia EGM-2 medio en un tubo de FACS. Lugar de forma vertical en la incubadora. (Esto será suficiente para unos 10 pozos. Escala hasta si es necesario)
- Se incuba durante 4 horas a 37 ° C, agitando el tubo cada 20 minutos. (Buena capa es crucial para la germinación.)
- Después de 4 horas, la transferencia de bolas recubiertas de un frasco T25 en 5 ml de EGM-2 y salir de O / N.
INTEGRACIÓN EN bolas recubiertas de gel de fibrina - DÍA 0
- Preparar el 2,0 mg / ml solución de fibrinógeno (Ver sección de recetas).
- Añadir 0,15 unidades / ml de aprotinina para la solución de fibrinógeno.
- Transferencia de bolas recubiertas de un tubo cónico de 15 ml y dejar cuentas resolver. Cuentas resuspender en 1 ml de EGM-2 y transferir a un tubo de centrífuga de 1,5 ml.
- Lavar las perlas de 3X con 1 ml de EGM-2 por pipeta hacia arriba y abajo lentamente.
- Contar con las cuentas de un cubreobjetos y se resuspenden en solución de fibrinógeno en una concentración de ~ 500 cuentas / ml.
- Añadir 0.625 unidades / ml de trombina a cada pocillo.
- Añadir 0,5 ml de la suspensión de fibrinógeno / cordón a cada pocillo de una placa de 24 pocillos.
Cambiar la punta de la pipeta para cada bien! - Mezclar la trombina y fibrinógeno por la que suben y bajan suavemente con la punta de la pipeta ~ 4 a 5 veces. Tenga cuidado de no hacer burbujas grandes.
- Dejar la placa durante 5 minutos en la capilla, luego se coloca en los 37 ° C incubadora durante 10-15 minutos para generar un coágulo.
- A la espera de que el coágulo, trypsinize fibroblastos.
- Añadir 1 ml de EGM-2 por así gota a gota.
- Fibroblastos de semillas en la parte superior del gel de fibrina en una concentración de 20.000 células por pocillo.
NOTAS:
Por lo general, cuando el gel de fibrina se forma, podrás ver pequeñas burbujas en el gel. No te preocupes, van a desaparecer en 3-4 días.
Cambiar los medios de comunicación cada dos días, es decir, el día 2, 4, 6, etc ..
El día 3 ó 4 que debe comenzar a ver brotar.
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Discussion
Existe un consenso creciente de que en tres dimensiones (3D) en los ensayos de la angiogénesis in vitro ofrecen un modelo que está mucho más cerca el entorno real en vivo que se puede lograr a partir de cultivos en 2D. Es evidente que los sistemas superiores de 3D debe ser reproducible, y ser capaz de imitar a varios de los pasos más importantes de la angiogénesis. Mientras que varios ensayos previa en 3D han sido desarrollados, muchos de estos o bien utilizar difíciles de obtener células microvasculares, o sólo recapitular algunas de las etapas. En este vídeo, describir y realizar una optimización en el ensayo de angiogénesis in vitro que utiliza la vena umbilical humana CE, que son fáciles de obtener y el más utilizado de la CE en la investigación vascular. El ensayo, en el transcurso de varios días, siempre reproduce los vasos largos con luces claro, patente intercelular rodeado de polarización CE. Etapas posteriores de la CE de ramificación y la fusión de los vasos (anastomosis) también se observan. Es importante destacar que en estas culturas las HUVEC se someten todos los cambios morfológicos que se observan con microvascular CE, ya sea en vivo o in vitro, incluyendo brotes, la migración, la alineación, la formación de la proliferación de tubo, las ramas y anastomosis. El perfil de expresión génica de los cambios HUVEC, en paralelo, se asemejan más a la de microvascular CE. En conclusión, se presenta un protocolo optimizado para un modelo de angiogénesis in vitro que resume varias etapas importantes de este proceso.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex-3 Beads | Reagent | Amersham | 17-0485-01 | 10 g/bottle. 1.0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH = 7.4) for at least 3 h at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker.2.Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).3.Discard the PBS and replace with fresh PBS:25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/ mL4.Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).5.Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115°C.6.Store it at 4°C. |
| Aprotinin | Reagent | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10 mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20 °C. |
| Fibrinogen Type I | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1 g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBSNote clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37 °C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.Sterile filter through 0.22 um |
| Thrombin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg = 1,000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20 °C. |
References
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
