Summary
Это видео демонстрирует протокол в анализе ангиогенеза пробирке, что повторяет несколько стадий ангиогенеза. Покадровый изображения прорастания, просвет образования, ветвление и анастомоза - ключевые особенности ангиогенез - это показано на рисунке.
Abstract
Ангиогенез представляет собой сложный многоступенчатый процесс, в котором, в ответ на ангиогенных стимулы, новые суда создаются из существующих сосудов. Эти шаги включают в себя: деградации базальной мембраны, пролиферации и миграции (прорастание) эндотелиальных клеток (ЕК) в внеклеточного матрикса, выравнивания ЕС в шнуры, ветвящийся, просвет образования, анастомоза, и формирование новой базальной мембраны. Многие в пробирке тесты были разработаны для изучения этого процесса, но большинство лишь имитируют определенные этапы ангиогенеза, и морфологически судов в анализах часто не похожи на судах в естественных условиях. На основе более ранних работ Nehls и Drenckhahn, мы оптимизировали в пробирке ангиогенеза анализа, который использует пупочной вены человека ЕС и фибробластов. Эта модель повторяет все ключевые ранних стадий ангиогенеза и, что немаловажно, судов дисплей патент межклеточных люмен окруженной поляризованной ЕС. ЕС покрыты на микроносителях cytodex и встроенных в гель фибрина. Фибробласты слой поверх геля, где они обеспечивают необходимый растворимых факторов, которые способствуют прорастанию ЕС с поверхности бусины. После нескольких дней, многочисленные суда присутствуют, которые можно легко наблюдается при фазово-контрастной и покадровой микроскопии. Это видео демонстрирует основные этапы в создании этих культур.
Protocol
ПОДГОТОВКА КЛЕТОК
- Вызовите HUVEC и фибробластов в M199/10% FBS / Пен-Strep (1:100) за 1-2 дня до бисером.
- Коммутатор средних EGM-2 (Clonetics) день до бисером для HUVEC и позавчера вложение для фибробластов.
- Концентрация ~ 400 HUVEC в шарик не требуется.
- 20000 фибробластов на лунку необходимо.
Покрытие бисера с HUVEC - ДЕНЬ -1
- Trypsinize HUVEC.
- Разрешить бусин для урегулирования (НЕ ЦЕНТРИФУГА!). Аспирируйте супернатант и мыть бисером кратко в 1 мл теплой EGM-2 среды.
- Mix 2500 бисером ж / 1x10 6 HUVEC в 1,5 мл теплой EGM-2 среды в трубке СУИМ. Поместите его вертикально в инкубаторе. (Этого будет достаточно для ~ 10 скважин. Масштабирование при необходимости)
- Инкубируйте в течение 4 часов при 37 ° С, пожимая трубку каждые 20 мин. (Хорошо покрытие имеет решающее значение для прорастания.)
- Через 4 часа, передача покрытием бисером T25 колбу в 5 мл EGM-2 и оставить O / N.
Вложение ПОКРЫТИЕМ бусины фибринового геля - ДЕНЬ 0
- Подготовка 2,0 мг / мл фибриногена решение (см. рецепт раздел).
- Добавить 0,15 ед / мл апротинина к фибриногена решение.
- Передача покрытых бисером 15 мл коническую трубку и пусть бисером обосноваться. Ресуспендируют бисером в 1 мл EGM-2 и передачи в 1,5 мл трубки центрифуги.
- Вымойте бисером 3X с 1 мл EGM-2 с помощью pipeting вверх и вниз МЕДЛЕННО.
- Граф бусины на покровное и ресуспендируют в фибриногена раствора при концентрации ~ 500 бусин / мл.
- Добавить 0,625 ед / мл тромбина в каждую лунку.
- Добавить 0,5 мл суспензии фибриногена / гранулы в каждую лунку 24-луночного планшета.
Изменение пипетки для каждой скважины! - Смешайте тромбина и фибриногена, идя вверх и вниз, осторожно кончиком пипетки ~ 4 до 5 раз. Будьте осторожны, чтобы не делать большие пузыри.
- Оставьте пластину в течение 5 мин в капюшоне, а затем поместить его в 37 ° С-инкубаторе в течение 10-15 мин для получения сгустка.
- В ожидании сгусток, trypsinize фибробластов.
- Добавить 1 мл EGM-2 на лунку падение мудрым.
- Семенной фибробластов поверх геля фибрина в концентрации 20 000 клеток на лунку.
ПРИМЕЧАНИЯ:
Обычно, когда геля фибрина образуется, то вы увидите крошечных пузырьков в геле. Не волнуйтесь, они исчезнут в течение 3-4 дней.
Изменение средств массовой информации каждый день, то есть 2 дня, 4, 6, и т.д. ..
Днем 3 или 4, вы должны начать видеть прорастания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существует растущий консенсус, что трехмерная (3D) в анализах пробирке ангиогенеза предлагаем модель, которая гораздо ближе к реальной среде, чем в естественных условиях можно добиться, используя 2D культур. Очевидно, что превосходное 3D-системы должны быть воспроизводимы, и будут способны имитировать некоторые из основных шагов ангиогенеза. Хотя несколько предыдущих 3D анализов были разработаны, многие из них либо использовать трудно получить микрососудистых клеток, или только резюмировать некоторые из этих этапов. В этом видео, мы описываем и выполнять оптимизированные в пробирке ангиогенеза анализа, который использует пупочной вены человека ЕС, которые легко доступны и наиболее часто используемых в ЕС сосудистых исследований. Анализ, в течение нескольких дней, последовательно воспроизводит долго судов с четкими, патентные межклеточных люмен окружении поляризованной ЕС. Позже этапы ЕС ветвление и слияние судов (анастомоза) также наблюдается. Важно отметить, что в этих культурах HUVEC пройти все морфологические изменения, которые видны с микрососудистых ЕС, либо в естественных условиях или в пробирке, в том числе прорастания, миграции, согласования, распространения, трубки формирования, ветвление и анастомоза. Профиль экспрессии генов HUVEC изменения, параллельно, чтобы более точно совпадать с микрососудистых ЕС. В заключение приведем оптимизированный протокол в модели ангиогенеза пробирке, что повторяет несколько важных этапов этого процесса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex-3 Beads | Reagent | Amersham | 17-0485-01 | 10 g/bottle. 1.0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH = 7.4) for at least 3 h at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker.2.Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).3.Discard the PBS and replace with fresh PBS:25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/ mL4.Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).5.Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115°C.6.Store it at 4°C. |
| Aprotinin | Reagent | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10 mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20 °C. |
| Fibrinogen Type I | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1 g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBSNote clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37 °C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.Sterile filter through 0.22 um |
| Thrombin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg = 1,000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20 °C. |
References
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
