Summary
Denna video visar protokollet från ett in vitro-angiogenes analysmetod som rekapitulerar flera stadier av angiogenes. Time-lapse bilder av groning, lumen bildning, förgrening och anastomos - viktiga funktioner i angiogenes - visas.
Abstract
Angiogenes är en komplicerad process i flera steg, där, som svar på angiogena stimuli, nya fartyg skapas från den befintliga kärlbädden. Dessa åtgärder inkluderar: nedbrytning av basalmembranet, spridning och migration (spirande) av endotelceller (EG) i den extracellulära matrisen, anpassning av EG i sladdar, förgrening, lumen bildning, anastomos och bildandet av en ny basalmembranet. Många in vitro-tester har utvecklats för att studera denna process, men de flesta bara härma vissa skeden av angiogenes, och morfologiskt fartygen i analyserna ofta inte liknar fartygen in vivo. Baserat på tidigare arbeten av Nehls och Drenckhahn, har vi optimerat en in vitro-angiogenes test som använder mänskliga EG navelsträngen ven och fibroblaster. Denna modell rekapitulerar alla de viktigaste tidiga stadierna av angiogenes och, viktigare, fartyg visas patentet intercellulära lumen omgiven av polariserad EG. EG är belagda på cytodex microcarriers och inbäddad i en fibrin gel. Fibroblaster är skiktade ovanpå gelen där de ger nödvändiga lösliga faktorer som främjar EG groning från ytan av pärlorna. Efter flera dagar, många fartyg är närvarande som lätt kan observeras i faskontrast och time-lapse mikroskopi. Denna video visar de viktigaste stegen för att inrätta dessa kulturer.
Protocol
FÖRBEREDELSER CELLER
- Ta fram HUVEC och fibroblaster i M199/10% FBS / Pen-streptokock (1:100) 1-2 dagar innan beading.
- Växla medellång till EGM-2 (Clonetics) dagen innan beading för HUVEC och dagen före bädda för fibroblaster.
- En koncentration av ~ 400 HUVEC per pärla behövs.
- 20.000 fibroblaster per brunn behövs.
Beläggning pärlor med HUVEC - DAG -1
- Trypsinize HUVEC.
- Låt kulor för att reglera (DO Centrifugera inte!). Aspirera supernatanten och tvätta pärlor kort i 1 ml varmt EGM-2 medium.
- Blanda 2500 pärlor w / 1x10 6 HUVEC i 1,5 ml varmt EGM-2 medium i en FACS-rör. Placera den vertikalt i inkubatorn. (Detta kommer att räcka för ~ 10 brunnar. Skala upp om det behövs)
- Inkubera i 4 timmar vid 37 ° C, skaka röret var 20 min. (Bra beläggning är avgörande för groning.)
- Efter 4 timmar, överföra belagda kulor till en T25 kolven i 5 ml EGM-2 och lämna O / N.
Bädda COATED pärlor i FIBRIN GEL - Dag 0
- Förbered 2,0 mg / ml fibrinogen-lösning (se recept avsnitt).
- Lägg till 0,15 enheter / ml av aprotinin till fibrinogen lösningen.
- Överföring belagd pärlor till en 15 ml koniska rör och låt pärlor lösa. Återsuspendera pärlor i 1 mL EGM-2 och överför till en 1,5 mL centrifugrör.
- Tvätta pärlor 3X med 1 mL EGM-2 genom att pipeting upp och ner långsamt.
- Räkna pärlor på ett täckglas och återsuspendera i fibrinogen lösning vid en koncentration av ~ 500 pärlor / ml.
- Lägg till 0,625 enheter / ml av trombin i varje brunn.
- Tillsätt 0,5 mL av fibrinogen / pärla upphängning i varje brunn på en 24-brunnar.
Ändra pipettspetsen för varje brunn! - Blanda trombin och fibrinogen genom att gå upp och ner försiktigt med pipettspetsen ~ 4 till 5 gånger. Var noga med att inte göra stora bubblor.
- Låt plåten i 5 minuter i huven, placera den i 37 ° C-inkubator för 10-15 min att generera en propp.
- I väntan på proppen, trypsinize fibroblaster.
- Tillsätt 1 mL EGM-2 per brunn droppvis.
- Seed fibroblaster på toppen av fibrin gel vid en koncentration på 20.000 celler per brunn.
ANMÄRKNINGAR:
Vanligtvis när fibrin gel bildas, kommer du att se små bubblor i gelen. Oroa dig inte, kommer de att försvinna i 3-4 dagar.
Ändra media varannan dag, dvs 2 Day, 4, 6, etc. ..
Genom dag 3 eller 4 bör du börja se groning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns en växande konsensus om att tredimensionella (3D) in vitro-angiogenes-analyser ger en modell som är mycket närmare den verkliga miljön in vivo än vad som kan uppnås med hjälp av 2D-kulturer. Det är uppenbart att överlägsen 3D-system ska vara reproducerbar, och kunna härma flera av de viktigaste stegen i angiogenes. Även om flera tidigare 3D-analyser har utvecklats, många av dessa använder antingen är svåra att få mikrovaskulära celler, eller bara sammanfatta några av de etapper. I denna video beskriver vi och utför en optimerad in vitro-angiogenes test som använder mänskliga EG navelsträng ven, som är lätt att få och den vanligaste EG i vaskulär forskning. Analysen, under loppet av flera dagar, konsekvent återger långa fartyg med tydliga, patent intercellulär lumen omgiven av polariserad EG. Senare stadier av EG förgrening och fusion av fartyg (anastomos) är också observeras. Viktigt i dessa kulturer att HUVEC genomgå alla de morfologiska förändringar som ses med mikrovaskulära EG, antingen in vivo eller in vitro, inklusive groning, migration, anpassning, spridning, rör bildande, förgrening och anastomos. Den genuttryck profil HUVEC förändringar, parallellt med närmare matchar mikrovaskulära EG. Avslutningsvis presenterar vi ett optimerat protokoll för en in vitro-angiogenes modell som rekapitulerar flera viktiga steg i denna process.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex-3 Beads | Reagent | Amersham | 17-0485-01 | 10 g/bottle. 1.0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH = 7.4) for at least 3 h at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker.2.Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).3.Discard the PBS and replace with fresh PBS:25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/ mL4.Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).5.Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115°C.6.Store it at 4°C. |
| Aprotinin | Reagent | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10 mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20 °C. |
| Fibrinogen Type I | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1 g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBSNote clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37 °C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.Sterile filter through 0.22 um |
| Thrombin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg = 1,000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20 °C. |
References
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
