Biology

Plast inbäddning och Sektionering av Xenopus laevis embryon

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/188

Souichi Ogata¹, Shimako Kawauchi¹, Anne Calof², Ken W.Y. Cho¹

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI), ²University of California, Irvine (UCI)

Summary

Plast sektioner upprätthålla sant vävnad morfologi i tunna delar av vävnad som kan immunostained med fluorescerande sekundära antikroppar, vilket gör denna metod mer användbar än paraffininbäddade eller frysta snitt för många typer av vävnad. Metoden för färgning, plast inbäddning och snittning visas i denna video.

Protocol

Fixering

Överför hela embryon eller dissekeras explants i MEMFA eller 3,7% FA + PBS i ett litet glas scintillation injektionsflaska (Fisher katt # 03 till 339-25B). Inkubera flaskan på nutator vid RT, endast för 2 timmar och inte mer än så. Lämna inte embryo i FA för mer än 2 timmar. Längre inkubation i FA kommer att göra embryonal vävnad hårdare och resultera i en dålig penetration av antikroppar i identifieringsprocessen.
Aspirera flesta av FA och lägga Dent är fixativ upp till toppen på flaskan (~ 4,5 ml). Vänd försiktigt injektionsflaskan några gånger för att tvätta embryon i Dent-talet, utbyte med en annan 4,5 ml av färsk Dent-talet, och inkubera det i -20 º C i minst 48 timmar. Övernattning är inte tillräckligt. Detta steg gör att embryon mer genomsläpplig för antikroppen. Embryon kan förvaras i detta tillstånd i flera veckor.

Immunofluorescens

Rehydrera provet. Inkubera i en graderad serie av metanol, enligt följande:

75% MeOH / H ₂ O 10min
50% MeOH / PBS 10min
25% MeOH / PBS 10min
PBS 10min
PBS 10min
Gör 1,5% agaros / PBS plåtar med 60mm plastskålar. Häll PBS ovanpå agarosen efter att det har blivit fast.
Hemi-sektionering av embryon: Sätt embryona i en 1,5% agaros / PBS tallrik. Ta ett embryo med en pincett och skär den i två halvor genom centrum av embryo med hjälp av en tunn rakblad. Välj de som du har lyckats halvera med en rak skärande plan.
Överför tudelas embryon i ett glas scintillation injektionsflaska med PBT. Exchange med 4,5 ml av 20% get serum + PBT. Inkubera vid RT för 2 timmar på en nutator (blockering).
Bered en lämplig spädning av den primära antikroppen i PBT. 0,5 ml av denna per prov behövs. Till exempel använde jag 1 / 200 utspädning av kanin anti-C-cadherin pAb att studera subcellulära lokalisering av C-cadherin i 5mm plast avsnitt.
Sug den blockerande lösningen och tillsätt 0,5 ml av den utspädda primära antikroppen. Lägg rören i stand-up position på en frigolit rörhållare. Inkubera över natten vid 4 º C på en nutator.
Ta bort den utspädda primära antikroppen (detta utspädd primär antikropp kan sparas och återanvändas i nästa 1-2 veckor). Tvätta med 4,5 ml av PBT för 4 gånger (40-60 minuter) vid RT.
Exchange med 0,5 ml 1 / 100 utspädning av Biotin-konjugerade sekundära antikroppar i PBT. Inkubera över natten vid 4 º C på en nutator. Täck rören med aluminiumfolie för att skydda biotin från ljus.
Från denna punkt, skall försiktighet vidtas för att skydda provet från ljus, dvs hålla flaskorna under några lock eller aluminiumfolie.
Ta bort Biotin-sekundär antikropp (detta kan också återanvändas i nästa 1-2 veckor). Tvätta med eller 4,5 ml av PBT för 4 gånger (40-60 minuter) vid RT.
Exchange med 0,5 ml 1 / 200 utspädning av fluorescerande-(FITC, Texas-röd etc.) Streptavidin i PBT. Inkubera över natten vid 4 º C på en nutator.
Ta bort streptavidin (detta kan återanvändas, också). Tvätta med 4,5 ml av PBT för 3 gånger (15 - 30 minuter) vid RT.
Fix embryona i 4,5 ml av 3,7% FA + PBS i 30 minuter vid RT.
Tvätta med 4,5 ml PBS två gånger.
Torka provet. Inkubera i en graderad serie av etanol, enligt följande:

30% EtOH / H ₂ O 10 min
50% EtOH / H ₂ O 10 min
75% EtOH / H ₂ O 10 min
100% EtOH 10 min
Provet kan förvaras i 100% EtOH vid 4 º C med ett lock för att skydda den mot ljus.

Infiltration

Gör Technovit 7100 infiltration mix. Jag brukar ta 15ml av basen vätska i ett 50 ml koniskt rör, lägga 150mg härdare jag och blanda det med gunga på en nutator i 15 minuter. Denna infiltration mix kan hållas vid 4 ° C i upp till en månad.
Infiltrera provet med infiltration blandningen genom att byta med en graderad serie av Technovit infiltration mix / EtOH combo, enligt följande:
1. 50% Technovit / EtOH - 1 timme
2. 100% Technovit - 1 timme
3. 100% Technovit - över en natt
Den specimen kan lagras i 100% infiltrationen blanda i upp till en månad vid 4 º C. Sätt ett lock på proverna för att skydda dem från ljus.

Bädda in

Gör Technovit 7100 bädda mix: Ta 0.75ml av infiltration blanda i ett 1,5 ml rör och tillsätt 50ml härdare II. Blanda genom att vända röret flera gånger.
Använd en plast överföringspipett, ta ett prov infiltrerade övernattning i 0.5ml tunnväggiga PCR-rör. Ta bort större delen av supernatanten.
Tillsätt 0.25ml av inbäddning mixen gjorde i steg # 1 i detta avsnitt, "Bädda in", till provet. Rikta in tudelas embryot att göra dissekering planet står inför till botten av röret, genom att försiktigt knuffa med en dov spets dissektion nål (trä-handtag dissektion nål).
Stäng locket och inkubera röret i en mörk plats i ca fyra timmar så att plasten polymerisera.
Gör Technovit 3040 mix. Ta 1 gram av pulvret till en vågskål, och tillsätt 0,5 ml av vätskan. Omedelbart, blanda pulver och vätska med en bluetip. Häll ovanpå härdade spacimen. Denna gula Technovit 3040 kommer att förhindra att hela plasten blocket kommer ut från röret.

Sektionering

Torka Histoknife H med xylen (EtOH är ofta inte tillräckligt bra) och ställ den på din mikrotomen. Vinkla bladet vid ca 45 °. Torka scenen området framför bladet med xylen också, eftersom renhet av detta område är avgörande för kvaliteten i sektionerade skivor.
Skär sidan av röret och dra av spetsen med en kartong kniv.
Ställ in prov i chucken innehavaren av mikrotomen.
Fäst en "press-to-tätning" kisel isolator på en bild glas för att göra ett montage kammare för avsnitt skivor. Ordentligt tryck på isolator på glaset på rena bänk och titta från andra sidan att se till att isolatorn är ordentligt utan luftbubblor. Häll rent och varmt dH ₂ O (~ 40 ° C) till poolen på bilden med hjälp av en pasteurpipett, upp till den nivå där den kan man se att vattenytan blir platt, inte konkav eller konvex form.
Börja göra avsnitt skivor. För immunofluorescens studier, gör jag 5 skivor mm avsnitt. För in situ hybridisering prover kan tjockleken på skivorna justeras i intervallet ~ 3 - 8 mm, beroende på syfte och intensiteten hos signalerna.
Bär avsnittet skivor från scenen framför bladet till montering kammaren med vatten, med en liten pensel. Håll pensel med en skiva ovanpå vattnet poolen och släpper skiva ned till vattnet genom att slå den med en dov spets dissektion nål. Segmentet kommer att expandera i en rund form så snart det träffar vattenytan.
När de flesta av vattnet yta montering kammaren är fylld med avsnitt skivor, suga upp nästan hälften av vattnet med en pasteurpipett. Inkubera bilden på en bild varmare över natten för att göra provet helt torr.
Counter-fläcken med 1 ml DAPI (0.1mg/ml i TE) i fem minuter. Aspirera DAPI och torra provet.
Ta bort isolatorn silikongummi från bilden. Nu bilder kan tas av provet. Förvara provet vid 4 ° C, skyddat från ljus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Buffer			1 L recipe: 8.0 g NaCl 0.2 g KCl 2.68 g Na₂HPO₄·7H₂O 0.2 g KH₂PO₄The pH is supposed to be 7.4. Adjust the volume to 1 L. Autoclave.
PBT	Buffer			Add 0.5 mLl of Triton X-100 and 1.0 g of BSA (Molecular Biology grade, fraction V is good [>99%], but don’t use crude 97% Albumin) to 500ml of autoclaved PBS. Filtrate through 0.2 mm filter cup. Store it in 4ºC.
·Dent’s fixative	Reagent			Mix 40 mL of methanol and 10 mL of DMSO. Keep it in –20°C.
3.7% FA+PBS	Reagent			Mix 37% formaldehyde and PBS at 1:9 ratios. Make it fresh at each time and discard the left over.
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-9200
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-1000
IG’S HUADS BIOTIN GTXRBT	Ab	Invitrogen	ALI3409	BioSource™
IgG (g), Goat Anti-Mouse	Ab	Invitrogen	M30115	CALTAG™
Fluorescent streptavidin kit	Reagent	Vector Laboratories	SA-1200	Contains streptavidin labeled with three different fluorophores (FITC, Texas Red and AMCA) suitable for this procedure.
20% goat serum/PBT	Buffer			This will be used as a blocking solution.
Small paintbrush	Tool
Dull-tip dissection needle	Tool
Kulzer Technovit 7100 GMA , 3040	Reagent		7100 GMA , 3040	glycol methacrylate
Kulzer Tungsten Histoknife H	Tool	Energy Beam Sciences	H1310
75% MeOH/H₂O	Buffer
50% MeOH/PBS	Buffer
25% MeOH/PBS	Buffer
30% EtOH/H₂2O	Buffer
50% EtOH/H₂O	Buffer
75% EtOH/H₂O	Buffer
100% EtOH	Buffer
Small glass scintillation vials	Tool	Fisher Scientific	03-339-25B
0.5 mL Thin-wall PCR tubes	Tool	Molecular BioProducts	3430
Press-to-Seal Silicone Rubber Insulators	Tool	Grace Bio-Lab Inc.	JTR1L-2.5	32 mm L x 19 mm W, 2.5 mm D
Thin razor blade	Tool
1.5% Agarose in PBS
Primary antibody against your antigen or epitope tags: Make an appropriate dilution in PBT.Biotin-conjugated secondary antibody: various vendors sell biotin-conjugated antibodies.