Summary
망막 신경절 세포는 눈의 작업 잠재력의 시퀀스와 뇌로 영상 정보를 전송. 여기, 우리는 하나의 신경절 세포의 활동 잠재력을 기록하는 방법을 보여줍니다
Abstract
시각 세계에 대한 정보가 시신경을 만들어 망막 신경절 세포 axons의 행동 잠재력의 시퀀스에있는 두뇌에 전송됩니다.
Protocol
부품 I : 텅스텐 - 인 - 유리 전극 제작
- 흑연 반지 나트륨 질산 (0.71g/mL)와 물 1 녹아 수산화 칼륨 (0.34g/mL)의 집중 솔루션으로 가득한 비커에 배치되며, 비커는 수정된 재봉틀의 바느질 겨드랑이 위치 .
- 텅스텐 와이어 (0.5mm 직경 6cm 길이)가 부분적으로 솔루션 (1-2cm) 잠겨 있도록 바느질 팔이 테이프로 붙여져 있습니다.
- 2V은 흑연 반지에 바느질 팔과 부정적인 리드에 긍정적인 리드를 부착하여 텅스텐 와이어에 걸쳐 적용됩니다.
- 재봉틀이 켜져 있고 텅스텐 와이어는 electrolytically 샵 포인트로 금속을 파 놓았 2 분에 대해 ~ 4Hz의 속도로 솔루션에 반복적으로 감소합니다.
- 에칭 와이어는 수동 micromanipulator과 유리 피펫 (0.25mm OD, 0.175mm ID) 유리 풀러와 1mm 팁로 뽑았의 샤프트와 미세한지도 (40x 배율)에서 정렬 지점에 배치됩니다. 와이어 삽입하는 동안 움직임을 방지하기 위해 유리가 일시적으로 퍼티로 현미경 단계로 보안이됩니다.
- 와이어는 조심스럽게 축 아래, 유리의 unpulled 끝에 고급이며, 1μm 개방을 통해 유리의 작은 조각은 유리에 텅스텐의 꽉 맞는를 나타내는, 비디오 팁을를 끊다을 볼 수 있습니다. 와이어 쥐 광섬유 레코딩을위한 팁 이외 5-10밀리미터 주변 연장해야합니다.
- Cyanoacrylate는 유리의 unpulled 끝에 적용되고 1MΩ 전극은 일반적으로 최고의 작품 어디 경화 후 전기 임피던스가 측정됩니다.
부 II : Stereotaxic 설치 및 스파이크 기차 레코딩
- 자극 디스플레이 시스템은 위치와 두뇌에 전극을 낮추는위한 stereotaxic기구 및 microdrive와 함께 비디오에 그림입니다.
- 망막 스파이크 열차 레코딩을 수행하려면 생쥐가 anesthetized 나중에 마비입니다. 표준 절차 (삽화가되지 않음) 약물 전달 및 마비 동안 기계적 환기를위한 tracheal (Y - 튜브) 정맥의 대퇴 정맥의 정맥의 삽입 수술을 위해 사용됩니다. 실험 동물 터미널입니다.
- 준비 절차 후, 동물은 난방 담요에 위치하고 있으며 머리는 귀 및 치아 바와 같은 쥐의 뇌 아틀라스 2 정의 stereotaxic 위치에 고정됩니다.
- 직장 프로브가 삽입됩니다, 이것은 37 체온을 유지 homeothermic 제어 장치 ° C. 통해 난방 담요를 제어
- 심전도 및 모니터 심장 박동수를 측정하는 리드와 같은 금속 바늘이 사용됩니다.
- 피부는 두개골 위에 개설하고 두개골 플레이트의 교차로는 (bregma) 노출됩니다. 맞춤 디자인 크로스바 프레임이 위치에 설정, 원형이 크로스바에 구멍 begma 주변 두개골에 표시된이며, 크로스바가 일시적으로 제거됩니다.
- stereotaxic 시스템은 bregma 통해 안내 바늘을 위치하여 보정합니다. 5 mm 구멍이 표시된 위치에 두개골에 몰락하고 뼈가 두뇌를 노출, 제거됩니다. 퍼티 얇은 반지는 장소로 재설정됩니다 크로스바에 구멍 주위에 도장을 형성하기 위해 두개골에 구멍 주위에 배치됩니다.
- 동물이 잠시 마취의 안정적인 비행기에있다면, 그것은 데이터 수집 중에 눈동자의 움직임을 방지하기 위해 중풍로 주입됩니다. 호흡 후 동물 기계적 통풍이 중지됩니다. 사용자 지정 프로그램은 실험을하는 동안 환기 및 생리 매개 변수를 추적하고 매개 변수가 정상 수준 밖에 나가서해야 보상 조치가 필요한 경우 실험자을 알려줍니다.
- 가이드 바늘은 텅스텐 전극과 backloaded과 두뇌로 저하됩니다. 뇌 침투 후 크로스바 구멍은 한천 (표시되지 않음)으로 가득합니다, 그리고 microdrive 조립은 기계적 안정성에 대한 크로스바에 고정되어 있습니다. 팁는 광학 chiasm가있는 두개골 아래 8~9밀리미터에 대한 때까지 텅스텐 전극은 다음 가이드 바늘 아웃 (2μm/sec) 천천히 고급입니다.
- 망막 신경절 세포에 속하는 스파이크 열차는 Visual 입력 자신의 반응에 의해 식별됩니다. 단일 광섬유의 분리시 기록된 세포의 수용 필드는 시각적 공간에서 매핑이며 응답 특성은 표류 통같이 또는 관심의 다른 시각적 패턴과 특징. 시스템의 안정성을 몇 시간 3의 단일 단위 레코딩을 허용합니다.
자료
성인 브라운 - 노르웨이 쥐 (250~400g)은 상업적인 공급 업체로부터 구입하여 규제 (12분의 12) 진한 / 라이트 사이클에 따라 보관되어 있었다. 마취는 마취제 하이드로 클로라이드와 xylazine (70과 2 MG / kg, 각각, 헨리 Schein 병원)의 intraperitoneal 주사로 유도하고 exper의 기간 동안 유지되었다카테터를 통해 정맥 호수 덱스 트로 오스와 혼합 마취제와 xylazine의 주입 (30 1 MG / ㎏ / HR) 및 gallamine의 triethiodide (40 MG / ㎏ / HR, 피셔 부동산) (0.13mm OD, 작은 부분 병원과 iment 오른쪽 대퇴 정맥에서). Gallamine는 눈동자의 움직임을 마비하는 혼합물에 포함되어 있습니다. 심장 박동과 혈압 변화에 의해 평가로 마취의 안정적인 비행기를 유지하는 데 필요한 같은 펌프 (WPI 병원)의 주입 속도가 조정되었습니다. 마비 후, 동물은 기계 최종 조류 CO 2 인 - 라인 측정 유지하기 위해 필요에 따라 조정 속도, 60-80 심호흡 / 분 (2cc 볼륨)에 tracheal 정맥을 통해 (하버드 장치, 모델 683) 통풍이되었습니다 capnometer (Novametrix 병원, 모델 710Sp) 30 %. 체온은 homeothermic 담요 제어 시스템 (하버드 장치 병원)을 통해 규제되었습니다. 체온, 최종 갯벌 CO 2, 심장 박동과 혈압이 지속적으로 LABVIEW 프로그램에 의해 실험을하는 동안 모니터링했다. 시각적 자극은 800x600 이상 픽셀의 해상도와 100 Hz에서에서 실행 소니 Multiscan 17e CRT 모니터 (30 CD / m 2의 휘도를 의미)에 발표했다. 데이터 수집 및 모니터 출력은 비디오 이미지 프로세서 (캠브리지 연구 시스템 병원, 비트 + +)와 Psychophysics 도구 상자 4 함께 Matlab와 LabView로 작성된 사용자 정의 소프트웨어와 제어했습니다. 동물 콘택트 렌즈 (안구 인스 트루먼 트의 병원)을 통해 16.5cm의 거리에 자극 디스플레이 (40.4 X 30.2 cm) 조회하고, 안과 솔루션은 촉촉한 눈을 유지하기 위해 실험 기간 동안 주기적으로 적용되었다. 자극에 액세스할 수 시야는 (공동 스토엘팅) 부동 테이블 (TMC 병원)의 표면 위에 고가 14cm stereotaxic 장치에있는 동물을 장착하고 함께 테이블에 옮겨 맞춤 설계 썰매에서 모니터 설정을 반대하여 최대화했습니다 코가에 대한 ± 100 데그 아크. 이것은 60 - 데그 이상 및 35 데그 눈높이 아래와 ± 42 - 데그 옆으로 모니터의 중심에서 확장 repositionable 표시 필드를 제공합니다. 텅스텐 electodes은 유리 팁을 형성하는 데 사용된 작은 부분 부동산과 프리드리히와 딤막 주식 회사 표준 micropippete 풀러 (셔터 인 스트 루먼트, 모델 P - 97)에서 얻은 사용자 borosilicate 유리에서 얻은 철사로 조작했다. 전극 임피던스 시험기는 박 - 전자에서 구입한했다. 전극은 전동 microdrive 시스템 (뉴 포트 병원, StepperMike)와 고급되었습니다. 심전도 및 시신경 신호는 높은 입력 임피던스 multielectrode 증폭기 (FHC 병원, X - 셀 3x4)으로 증폭하고 필터링되었습니다. 심장 박동은 윈도우 discriminator (WPI 병원, 모델 121)을 발견했다. 신경 행동 잠재력은 디지털 대못 discriminator (FHC 병원, APM)에 의해 0.1ms 해상도 감지와 시간 스탬프를했다. 스파이크 스파이크 discriminator은 시간이 자극에 잠겨 있었 있도록 비디오 이미지 프로세서에서 트리거 신호에 의해 문이되었다.
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Discussion
광섬유 레코딩이 그대로 눈에 필요한 망막 정보 인코딩 및 전송에 관한 실험적 질문을 해결하기위한 매력적인 접근 방식입니다. 전극은 광학 chiasm이나 교차 및 교차되지 않은 시신경 섬유의 활동이 하나의 전극 침투로 기록될 수 트랙트의 위치에있는 경우 또한, 두 눈의 신호 특성이 거의 같은 생리적 상태에서 공부하실 수 있습니다. 광섬유 레코딩은 그들의 작은 크기에 아마도 때문에 설치류 같은 비전 연구에 사용되는 다른 인기있는 동물 모델에서 고양이의 공통점지만 없습니다. 우리는 쥐를의 단일 섬유 움직임에 성공할 수 있었던 없음 중 유사한 임피던스와 소재의 상업 전극의 다양한 시도가, 우리의 전극 수와 같은 몇 시간을 위해 녹음을 혼자하자. 이것은 전형적인 상업 자들의 넓은 무딘 팁 반대로 긴 날카로운 팁을 가지고 우리의 전극,의 특정 기하학이 신경절 세포 축삭 스파이크 열차의 신뢰성과 안정 절연을 위해 중요하다는 것을 의미합니다. 이 전극을 조작하는 방법을 보여주는 이외에도, 우리는 생체내 영상 neurophysiological 연구를위한 맞춤 설계 stereotaxic 시스템을 보여줍니다. 시스템은 환경 진동로부터 전자기 잡음의 높은 임피던스 microelectrode을 보호하기 위해 구성되어 있습니다. 이것은 특히 인근 위치 컴퓨터 모니터, 시간 연장 기간 동안 axons (같은 세포 기관에 비해)에 의해 만들어진 작은 행동 잠재력을 녹음 중요합니다. 그것은 시간 더 microvolts 수만의 순서에 소음의 일반적인 녹화 시간과 함께, 뛰어난 안정성과 신호 대 잡음 비율로 그렇게 않습니다. 이러한 기능은 망막이나 다른 뇌 영역의 신경 섬유의 생체내의 기록을 목표로 비전 연구자에 대한 설정이 특히 유용합니다.
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Disclosures
모든 실험 절차는 보스턴 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
Acknowledgments
우리는이 실험 기술의 발전 중에 기술 입력을 제공하는 박사 댄 그린 주셔서 감사합니다. 이 작품은 NIH 그랜트 R01 - EY016849A와 스미스 패밀리 새로운 탐정 수상에 의해 지원되었다.
References
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- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Fourth Edition, Academic Press. London, UK. (1998).
- Freeman, D. K., Heine, W. F., Passaglia, C. L. The maintained discharge of rat retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 25 (4), 535-548 (2008).
- Brainard, D. H.
