Singola unità In vivo Registrazioni dal chiasma ottico di Rat

Summary

Cellule gangliari della retina trasmettere informazioni visive dall'occhio al cervello con sequenze di potenziali d'azione. Qui, dimostriamo come registrare le potenziali d'azione delle cellule gangliari singolo

Abstract

Informazioni sul mondo visivo viene trasmesso al cervello in sequenze di potenziali d'azione negli assoni delle cellule gangliari retiniche che formano il nervo ottico.

Protocol

Parte I: Fabbricazione di tungsteno-in-vetro Elettrodi

1. Un anello di grafite è posto in un bicchiere riempito con una soluzione concentrata di nitrato di sodio (0.71g/mL) e idrossido di potassio (0.34g/mL) disciolto in acqua ¹ e la coppa è posta sotto il braccio di cucitura di una macchina da cucire modificato .
2. Filo di tungsteno (0,5 mm di diametro, lunghezza 6cm) è registrato al braccio di cucitura in modo che sia parzialmente immersa (1-2cm) in soluzione.
3. 2V vengono applicati attraverso il filo di tungsteno collegando un cavo positivo al braccio da cucire e un conduttore negativo al anello in grafite.
4. La macchina da cucire è accesa e il filo di tungsteno viene immerso ripetutamente in soluzione ad una velocità di circa 4 Hz per 2 minuti, che incide elettroliticamente il metallo a una punta acuminata.
5. Il filo inciso è posto su un micromanipolatore manuale e il punto allineati sotto la guida microscopica (ingrandimento 40x) con l'albero di una pipetta di vetro (0,25 mm OD, ID 0,175 millimetri) tirato a una punta 1mm con un estrattore di vetro. Per evitare qualsiasi movimento durante l'inserimento del filo, il vetro è temporaneamente fissata al palco microscopio con stucco.
6. Il filo è attentamente avanzate nel fine unpulled del vetro, giù l'albero, e attraverso l'apertura 1μm Un piccolo pezzo di vetro è visto di troncare la punta nel video, che indica una perfetta aderenza del tungsteno nel bicchiere. Il filo dovrebbe estendere a circa 5-10mm oltre la punta per le registrazioni in fibra ottica di ratto.
7. Cianoacrilato è applicato alla fine unpulled del vetro e dopo l'indurimento l'impedenza elettrica è misurata, in cui elettrodi 1M in genere funzionano meglio.

Parte II: installazione e Stereotassica Recordings Train Spike

1. Il sistema di visualizzazione stimolo è illustrato nel video, insieme con l'apparato stereotassico e microdrive per il posizionamento e abbassare l'elettrodo nel cervello.
2. Per eseguire le registrazioni della retina treno punta il topo è anestetizzato e poi paralizzato. Procedure standard (non illustrato) sono utilizzati per l'inserimento di una cannula chirurgica vena femorale per la consegna della droga e un tracheale (Y-tube) cannula per la ventilazione meccanica durante la paralisi. Gli esperimenti sono terminali per l'animale.
3. Dopo le procedure preliminari, l'animale viene posto sulla coperta di riscaldamento e la testa è fissata in posizione stereotassica, come definito dal cervello di ratto atlante ^2, con l'orecchio e bar dente.
4. La sonda rettale è inserito, che controlla la coperta di riscaldamento tramite una unità di controllo homeothermic che mantiene la temperatura corporea a 37 ° C.
5. Aghi di metallo vengono utilizzate come porta per misurare l'elettrocardiogramma e cardiofrequenzimetro.
6. La pelle è aperto sulla parte superiore del cranio e l'intersezione di lastre del cranio (bregma) è esposto. Una cornice personalizzata traversa si trova in posto, un cerchio è segnato sul cranio intorno begma attraverso un foro nella traversa, e la traversa viene temporaneamente rimosso.
7. Il sistema stereotassico è calibrato con il posizionamento dell'ago guida nel bregma. A 5 mm foro è perforato il cranio nella posizione indicata e l'osso è rimossa, esponendo il cervello. Un anello sottile di stucco è posizionato intorno all'apertura nel cranio per formare un sigillo attorno al foro della traversa, che viene riportato in posizione.
8. Se l'animale è stato in un piano stabile di anestesia per un po ', viene iniettato con paralitico al fine di prevenire i movimenti oculari durante la raccolta dei dati. Dopo respiro si ferma l'animale è a ventilazione meccanica. Un programma personalizzato tracce parametri di ventilazione e fisiologica per tutto l'esperimento e informa lo sperimentatore se l'azione di compensazione è necessario alcun parametro dovrebbe uscire livelli normali.
9. L'ago guida è backloaded con l'elettrodo di tungsteno e chino nel cervello. Dopo la penetrazione cervello traversa il foro è pieno di agar (non mostrato), e l'assemblea microdrive è bloccato per la traversa per la stabilità meccanica. L'elettrodo di tungsteno è poi lentamente avanzato (2μm/sec) l'ago guida fino a quando la punta è di circa 8-9mm sotto il cranio, dove si trova il chiasma ottico.
10. Treni di impulsi appartenenti a cellule gangliari della retina sono identificati dal loro risposta a un input visivo. Su isolamento di una singola fibra ottica del campo recettivo della cellula registrato è mappato nello spazio visivo e le sue proprietà di risposta sono caratterizzate da grate fisse o altri modelli visivi di interesse. La stabilità del sistema permette di singole unità registrazioni di alcune ore ^3.

Materiale

Adulti Brown-Norvegia ratti (250-400g) sono stati acquistati da un fornitore commerciale e alloggiati sotto un mercato regolamentato (12/12) ciclo luce / buio. L'anestesia è stata indotta con una iniezione intraperitoneale di cloridrato di ketamina e xilazina (70 e 2 mg / kg, rispettivamente, Henry Schein Inc) e mantenuta per la durata della compeanche provare una infusione endovenosa di ketamina e xilazina (30 e 1 mg / kg / ora) miscelato con destrosio, soluzione salina, e triethiodide gallamine (40 mg / kg / ora, Fischer Inc) attraverso un catetere (0,13 mm OD, parti piccole Inc ) nella vena femorale destra. Gallamine è incluso nella miscela per paralizzare i movimenti degli occhi. La velocità di infusione della pompa (WPI Inc) è stato regolato secondo necessità per mantenere un aereo stabile di anestesia valutata mediante la frequenza cardiaca e della pressione arteriosa variabilità. Dopo la paralisi, l'animale era in ventilazione meccanica (Harvard Apparatus, Modello 683) attraverso una cannula tracheale a 60-80 atti / min (2 cc di volume), con un tasso aggiustato in modo da mantenere la end-tidal CO ₂ misurata con un filtro in linea capnometro (Novametrix Inc, Modello 710Sp) al 30%. La temperatura corporea è regolata tramite un sistema di controllo homeothermic coperta (Harvard Apparatus Inc). Temperatura corporea, end-tidal cuore CO _2, il tasso, e la pressione sanguigna sono stati continuamente monitorati per tutta l'esperimento con un programma LabVIEW. Stimoli visivi sono stati presentati in una Multiscan Sony 17e monitor CRT (media luminanza di 30 cd / m ²⁾ in esecuzione a 100 Hz con una risoluzione di 800x600 pixel. Acquisizione dati e di un'uscita monitor sono stati controllati con il software personalizzato scritto in Matlab e LabView in combinazione con un processore di immagini video (Cambridge Research Systems Inc, Bits + +) e la Psicofisica Toolbox ^4. L'animale visto il display stimolo (40,4 x 30,2 cm) a una distanza di 16,5 centimetri attraverso lenti a contatto (Ocular Instruments Inc), e la soluzione oftalmica è stata applicata periodicamente durante l'esperimento di tenere gli occhi umidi. Il campo visivo accessibile alla stimolazione è stato massimizzato il montaggio invertire l'animale in un apparato stereotassico (Stoelting Co) 14 centimetri elevata sopra la superficie di una tavola galleggiante (TMC Inc) e impostare il monitor su un design personalizzato slitta che si muoveva sul tavolo lungo arco di ± 100 gradi circa il naso. Questo ha fornito un campo riposizionabile schermo che si estendeva per 60 ° sopra e 35 gradi sotto il livello degli occhi e ± 42 gradi lateralmente dal centro del monitor. Electodes tungsteno sono stati fabbricati con fili ottenuti da piccole parti Inc e personalizzate in vetro borosilicato ottenuti da Friedrich e Dimmock Inc. Uno standard micropippete estrattore (Sutter Instruments, modello P-97) è stato utilizzato per modellare la punta di vetro. Il tester impedenza elettrodo è stato acquistato da Bak-Electronics. Elettrodi sono stati avanzati con un microdrive motorizzato (Newport Inc, StepperMike). Elettrocardiogramma ed i segnali del nervo ottico sono stati amplificati e filtrati con un amplificatore ad alta impedenza di ingresso multielectrode (FHC Inc, X-Cell 3x4). Battiti cardiaci sono stati rilevati con un discriminatore finestra (WPI Inc, Modello 121). Potenziali d'azione del nervo sono stati rilevati e marcati temporalmente con risoluzione 0,1 ms da un picco digitale discriminatore (FHC Inc, APM). Il discriminatore mediati dal picco è stato un segnale di trigger dal processore di immagini video in modo che i tempi di picco sono stati bloccati allo stimolo.

Discussion

Registrazioni in fibra ottica sono un approccio interessante per affrontare questioni sperimentali sulla codifica le informazioni della retina e la trasmissione che richiedono un occhio intatto. Inoltre, le proprietà di segnalazione di entrambi gli occhi possono essere studiati in praticamente nello stesso stato fisiologico se l'elettrodo è posizionato nel chiasma ottico o delle vie dove l'attività di incrociati e non incrociati fibre del nervo ottico possono essere registrati con una penetrazione del singolo elettrodo. Registrazioni in fibra ottica sono comuni nei gatti, ma non in altri popolari modelli animali utilizzati nella ricerca sulla visione, come i roditori, forse a causa della loro piccola dimensione. Abbiamo provato una serie di elettrodi commerciale di impedenza simili e materiale, nessuno dei quali sono riusciti a far salire singola attività in fibra nel ratto, per non parlare di registrazione che per diverse ore come il nostro elettrodi. Ciò implica che la geometria particolare del nostro elettrodi, che hanno una lunga punta acuminata in contrasto con la punta smussata gamma di tipici quelli commerciali, è importante per un isolamento sicuro e stabile delle cellule gangliari assone treni di impulsi. Oltre a mostrare come fabbricare questi elettrodi, che illustrano il nostro progettato su misura per il sistema stereotassico nel campo della ricerca in vivo visivo neurofisiologici. Il sistema è costruito per proteggere il microelettrodo alta impedenza da vibrazioni ambientali e dal rumore elettromagnetico. Questo è fondamentale per la registrazione del potenziale d'azione prodotta da piccoli assoni (rispetto a corpi cellulari) per un periodo prolungato di tempo, specialmente con un monitor di un computer posizionato nelle vicinanze. Lo fa con la stabilità eccezionale e rapporto segnale-rumore, con tempi di registrazione tipica di un'ora o più e livelli di rumore dell'ordine di decine di microvolt. Queste caratteristiche rendono la configurazione particolarmente utile per i ricercatori visione lo scopo di registrare in vivo da fibre nervose della retina o di altre regioni del cervello.