Tek birim In vivo Kayıtlar

Summary

Göz retina ganglion hücrelerinin aksiyon potansiyellerinin beyin dizileri ile görsel bilgi iletir. Burada, tek ganglion hücrelerinin aksiyon potansiyelleri kayıt nasıl göstermek

Abstract

Görsel dünya hakkında bilgiler, retina ganglion hücrelerinin aksonları optik sinir aksiyon potansiyelleri dizileri beyne iletilir.

Protocol

Bölüm I: Tungsten-Cam Elektrotlar Fabrikasyon

1. Grafit halka sodyum nitrat (0.71g/mL) ve potasyum hidroksit (0.34g/mL) ¹ su içinde çözünmüş konsantre solüsyonu ile dolu bir behere konur ve beher değiştirilmiş bir dikiş makinesi dikiş kol altına yerleştirilir .
2. Tungsten tel (0,5 mm çap, 6cm uzunluğunda) kısmen çözüm (1-2cm) batırılır, böylece dikiş koluna bantlanmış.
3. 2V grafit halka dikiş kol ve olumsuz bir kurşun olumlu bir kurşun takarak tungsten tel üzerinden uygulanır.
4. Dikiş makinesi açık ve tungsten tel elektrolitik metal sivri etches 2 dakika için ~ 4Hz bir oranda çözüm tekrarlayan daldırılır.
5. Kazınmış tel manuel mikromanipülatör ve mikroskobik cam bir pipet (0.25mm OD, 0.175mm ID), bir bardak çektirmesi ile 1mm ucu çekti mil ile rehberlik (40x büyütme) altında dizilen noktası üzerine yerleştirilir. Tel yerleştirilmesi sırasında hareket etmesini önlemek için, cam, macun ile mikroskop aşamasında geçici olarak güvence altına alınmıştır.
6. Dikkatli bir mil aşağı tel, cam unpulled ucunu gelişmiş, ve 1 mikrona kadar açıklıktan küçük bir cam parçası, cam, tungsten sıkı bir uyum gösteren video ucu koparak görülür. 5-10mm çevresinde tel sıçan fiber optik kayıtlar için ipucu ötesine uzatmak gerekir.
7. Siyanoakrilat cam unpulled sonuna kadar uygulanır ve sonra elektrik empedansı 1M elektrotlar genellikle en iyi çalışmalarınızı sertleşme ölçülür.

Bölüm II: Stereotaksik Kurulum ve Spike Tren Kayıtlar

1. Uyaran ekranı, video sistemi, konumlandırma ve beyin içine elektrod düşürücü stereotaksik aparatı ve Microdrive birlikte gösterilmiştir.
2. Retina başak tren kayıtlarını gerçekleştirmek için sıçan anestezi ve daha sonra felç. Standart işlemleri (resimli), cerrahi, ilaç dağıtım ve felç sırasında mekanik ventilasyon trakeal kanül (Y-tüp) için femoral ven kanül yerleştirilmesi için kullanılır. Deneyler, hayvan için terminal.
3. Hazırlık süreçlerini sonra, hayvan ısıtma battaniye konur ve baş, kulak ve diş barlar ile sıçan beyin ^atlası 2 tarafından tanımlandığı gibi, stereotaksik konuma sabittir .
4. Rektal prob eklenir, 37 vücut ısısını korur bir homeothermic kontrol ünitesi ° C ile ısıtma battaniye kontrol
5. Metal iğne, elektrokardiyogram ve monitör kalp hızı ölçmek için neden olarak kullanılır.
6. Cilt kafatasının üstüne açılır ve kafatası plakaları kesiştiği (bregma) maruz kalmaktadır. Özel tasarımlı ızgaraya çerçeve yerine, bir daire ve üst direğin bir delikten begma çevresindeki kafatası üzerinde işaretlenmiş ve enine geçici olarak kaldırılır.
7. Stereotaksik bregma üzerinde kılavuz iğne konumlandırma sistemi kalibre edilir. 5 mm delik işaretli yerde kafatası delinmiş ve kemik, beyin açığa çıkarılır. Macunu ince bir halka yerleştirin sıfırlanır enine, delik etrafında bir mühür formu kafatası açılış etrafında yer almaktadır.
8. Hayvan süre için anestezi istikrarlı bir uçak varsa, veri toplama sırasında göz hareketlerini önlemek amacıyla paralitik ile enjekte edilir. Sonra hayvan mekanik ventilasyon solunum durur. Özel bir program deney boyunca havalandırma ve fizyolojik parametrelerini izler ve normal seviyelere dışında herhangi bir parametre gitmeli telafi edici eylem ihtiyaç duyulması halinde, deneyci bilgilendirir.
9. Kılavuz iğne tungsten elektrot ile backloaded ve beyin içine indirdi. Beyin penetrasyon sonra enine delik agar (gösterilmemiştir) ile doludur ve Microdrive montaj, mekanik stabilite için üst direğe bağlanarak. Tungsten elektrot ucu optik kiazma bulunan kafatası, aşağıdaki 8-9mm kadar sonra yavaş yavaş gelişmiş kılavuz iğne dışarı (2μm/sec).
10. Spike retina ganglion hücrelerinin ait trenler görsel girişine tepki tanımlanır. Tek bir fiber optik izolasyon üzerine kaydedilen hücrenin alıcı alan görsel alanı eşleştirilir ve tepki özellikleri sürüklenen ızgaralar veya ilgi diğer görsel kalıpları ile karakterizedir. Tek birim kayıtları için birkaç saat ³ sistemin istikrarı sağlar.

Malzemeler

Yetişkin Brown-Norveç sıçan (250-400g), ticari bir satıcıdan satın alınan ve regüle (12/12) aydınlık / karanlık döngüsü altında alır. Anestezi ketamin hidroklorür ve ksilizin (70 ve 2 mg / kg, sırasıyla, Henry Schein Inc) intraperitoneal enjeksiyonu ile indüklenen ve exper süre için muhafaza edildituzlu dekstroz ile karışık bir kateter aracılığı ile intravenöz ketamin ve ksilizin infüzyon (30 ve 1 mg / kg / saat) ve gallamine triethiodide (40 mg / kg / saat, Fischer A.Ş.) (0.13mm OD, Küçük Parça A.Ş. ile iment sağ femoral ven). Gallamine karışımı göz hareketleri felç dahildir. (TEFE A.Ş.) pompa infüzyon hızı, kalp hızı ve kan basıncı değişkenliği ile değerlendirilen anestezi istikrarlı bir düzlemde korumak için gerektiği şekilde ayarlandı. Felç sonra, hayvan mekanik end-tidal CO _{2 'in-line} ile ölçülen korumak için gerekli olarak ayarlanır oranı ile 60-80 solunum / dk (2CC hacmi) (Harvard Apparatus, Model 683) trakeal kanül aracılığı ile havalandırılan oldu capnometer (Novametrix Inc Model 710Sp)% 30 oranında. Vücut ısısı homeothermic battaniye kontrol sistemi (Harvard Apparatus Inc) ile düzenlenmiştir. Vücut ısısı, end-tidal CO _2, kalp hızı ve kan basıncı sürekli bir LABVIEW program tarafından deneme boyunca takip edildi. Görsel uyaranlara 800x600 piksel çözünürlüğe sahip 100 Hz hızında çalışan bir Sony Multiscan 17e CRT monitör (30 cd / m ² parlaklık anlamına) sunuldu. Veri toplama ve monitör çıkışı bir video görüntü işlemcisi (Cambridge Araştırma Sistemleri A.Ş., Bit + +) ve Psikofizik Toolbox ⁴ ile birlikte Matlab ve LabView yazılmış özel bir yazılım ile kontrol altına alındı ​​. Hayvan kontakt lensler (Oküler Instruments Inc) üzerinden 16,5 cm mesafe uyaran ekran (40,4 x 30,2 cm) görülüyor ve oftalmik solüsyon deney sırasında gözleri nemli tutmak için periyodik olarak uygulandı. Stimülasyonu için görme alanı (Stoelting Co) yüzen bir tablo (TMC A.Ş.) yüzey üzerinde yükselmiş 14cm stereotaksik aparat hayvan montaj ve birlikte masaya taşınan özel tasarlanmış kızak üzerindeki monitör ayarı ters büyütülmeden burun hakkında ± 100 derece ark. Bu 60 derece yukarıda ve 35 derece göz seviyesinin altında ve ± 42 derece yanal monitör merkezinden genişletilmiş bir yerini değiştirebilirler ekran alanı sağladı. Tungsten electodes cam ucu şeklini Küçük Parça A.Ş. ve Friedrich ve Dimmock Inc standart bir micropippete çektirmesi (Sutter Instruments, Model P-97) elde edilen özel borosilikat camdan elde edilen tel ile imal edildi. Elektrot empedansı test Bak-Elektronik satın alınmıştır. Elektrotlar motorlu Microdrive sistemi ile gelişmiş (Newport Inc StepperMike). Elektrokardiyogram ve optik sinir sinyallerinin yüksek empedans girişli bir multielectrode amplifikatör (FHC A.Ş., X-Cell 3x4) ile amplifiye ve süzülür. Kalp atım bir pencere discriminator (TEFE Inc Model 121) ile tespit edildi. Sinir aksiyon potansiyeli 0,1 ms çözünürlüğe sahip bir dijital başak discriminator (FHC A.Ş., APM) tarafından algılanır ve zaman damgalı. Başak başak kez uyaran kilitli olduğunu, böylece video görüntü işlemcisi, bir tetikleme sinyali tarafından discriminator kapılı idi.

Discussion

Fiber optik kayıtlar sağlam bir göz gerektiren retina bilgi kodlama ve iletimi ile ilgili deneysel sorulara yanıt için cazip bir yaklaşım. Ayrıca, optik kiazma ya da yolu geçti ve çizgisiz optik sinir liflerinin aktivitesi tek bir elektrot penetrasyon ile kaydedilebilir elektrot yerleştirilmiş ise her iki gözü sinyalizasyon özellikleri hemen hemen aynı fizyolojik durumu incelenmelidir. Fiber optik kayıtları ortak vizyon araştırma, belki de kendi küçük boyutu sayesinde kemirgenler gibi diğer popüler hayvan modelleri, kedi değil. Biz sıçan tek lif aktivitesi toplayıp başarılı bunlardan hiçbiri benzer empedans ve malzeme ticari elektrotlar, çeşitli denedi, bizim elektrotlar gibi birkaç saat için kayıt bırakın. Bu, tipik ticari olanları geniş künt ucu aksine uzun, sivri uçlu olan elektrotlar, özellikle geometri, ganglion hücre akson başak trenler, güvenilir ve istikrarlı bir izolasyonu için önemli olduğunu ima eder. Bu elektrotlar nasıl imal etmek gösteren ek olarak, in vivo görsel nörofizyolojik araştırma için özel tasarlanmış stereotaksik sistemi göstermektedir. Bu sistem, çevresel titreşim ve elektromanyetik gürültü yüksek empedans mikroelektrot korumak için inşa edilmiştir. Bu, özellikle Yakın yerleştirilmiş bir bilgisayar monitörü, zaman uzun bir süre aksonlar (as hücre gövdeleri ile karşılaştırıldığında) tarafından üretilen küçük bir aksiyon potansiyelleri kayıt için kritik öneme sahiptir. Bu, bir saat veya daha fazla ve onlarca mikrovolt sırasını gürültü düzeyleri tipik kayıt süreleri, olağanüstü istikrar ve sinyal-gürültü oranı ile bunu yapar. Bu özellikler, kurulum, retina ya da diğer beyin bölgelerine sinir lifleri in vivo olarak kayıt amaçlayan görme araştırmacılar için özellikle yararlı olun .