Summary
Мы опишем метод анализа изменения N-связанных гликанов через ранней жизни гликопротеинов после их биосинтеза в клетках млекопитающих. Это достигается методом широтно-погони анализ метаболически помечены гликанов, ферментативные освобождения из гликопротеинов и обследование с помощью ВЭЖХ.
Abstract
Крепление Glc
Protocol
Следующий протокол предназначен для анализа сахара цепи от общего числа гликопротеины или конкретных гликопротеин интересов. Процедура в основном те же в обоих случаях с некоторыми изменениями, как указано в тексте всего протокола.
- Для метаболической маркировки N-связанных гликанов нужно использовать subconfluent культуре клеток млекопитающих выращивали в течение ночи в 90 мм блюдо для каждого образца (образцы могут представлять различные моменты времени или лечения). Этот протокол оптимизирован для NIH 3T3.
- Голодать клеток для глюкозы путем инкубации в 5 мл свежеприготовленного подогретого (37 ° C) среде без глюкозы, поставляется с 10% FCS диализу и 4 мМ пирувата натрия в течение 5-15 минут.
- Замените голода среде с 1 мл подогретого (37 ° С) без глюкозы среде, содержащей 400 мкКи [2 - 3 H]-меченого маннозы (низкая концентрация 65 мкКи / мл применяется для маркировки от общего числа гликопротеины), и инкубировать клетки в нормальные ткани условий культивирования в течение 1 часа.
- Удалить маркировки среды от каждого образца, и осторожно добавить 2 мл PBS при 4 ° С до образцы соответствующего импульса и разместить их на лед (эти образцы называются импульсов), в то время образцы соответствующих погони должны быть промыть 3 раза с 2 мл подогретого (37 ° С) нормальной полной среде, культуре, а затем помещается в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° C с 5 мл подогретого регулярной среде для желаемого погони периоды.
- Промыть импульса образцов (ранее размещенных на льду) 3 раза с 2 мл ледяной PBS. Клетки затем соскрести блюдо в 2 мл PBS с помощью мобильного скребок, и помещается в трубке 2 мл Эппендорф.
- Короткая спина клеток 16000Xg (6-10 сек), отбросить супернатант и заморозить осадок клеток при -80 ° C.
- Выполните пункты 5 и 6, и для погони образцы в конце время погони.
- Удалить клеток из морозильной камеры и лизировать их путем добавления 300 мкл буфера, вортексе кратко и инкубации в течение 20 минут на льду, или в случае полного анализа гликопротеины, путем инкубации 20 мин на льду с буфером B, а затем с помощью ультразвука (4 раза, 10 сек, максимальная амплитуда), а затем кипятить образцов для 5мин.
- Центрифуга лизатов на 16000Xg в течение 20 мин при 4 ° C. Передача супернатант в новой трубки Эппендорфа и отбросить гранул.
- Если в результате анализа общего гликопротеины, переходите к молекулярной фильтрации и Дегликозилирование (шаг 17). Для иммунопреципитации гликопротеин Н2а продемонстрировали здесь, добавьте 20l/sample часть (Repligen) белка-агарозы бисером 1:01 подвеской и 3 мкл / образец нашего кролика поликлональных антител анти Н2а для желаемого гликопротеин (в нашем примере анти-антител Н2а ), к надосадочной с шага 9.
- Инкубируйте образцы для 4-16 часов при 4 ° С, постоянно перемешивания медленного вращения.
- Спином вниз бисером на 16000Xg течение 30 секунд, и осторожно удалите супернатант использованием вакуума.
- Промыть бусы, путем добавления 500 мкл буфера D и вортексе. Спиновые как в шаге 12 и удалите супернатант. Повторите промыть 3 раза.
- Добавить 10 мкл буфера денатурации (поставляется с NEB эндо-H комплект), чтобы шарик шарик и варить образцы в течение 5 мин (при общих белков анализируются, Дегликозилирование осуществляется на микроконтроллер фильтр, шаг 17).
- Спином вниз шарики (16000Xg в течение 30 секунд), и передача супернатант в новую пробирку Эппендорф. Затем 0.5μl ферментов эндо H добавляются к каждому образцу вместе с 10 мкл реакционного буфера (также поставляется с NEB эндо H комплект), а также образцы инкубируют при 37 ° С в течение 3 часов.
- Чтобы отделить выпущены гликанов из белков, образец разбавляют в 5 раз деионизированной водой и помещается в верхней части молекулярного фильтра (микроконтроллер Ultracel YM30), с 30kDa отсечки, затем центрифугировали при 14000Xg в течение 3 мин. Применяют 50 мкл деионизованной воды и повторить центрифугирования образцов. Это вымывание повторяется еще 2 раза, сохраняя проточные.
- Если вы анализируете общего гликопротеины, применять супернатанта лизаты (с шагом 9), фильтр микроконтроллер. Вымойте экстракт с 100 мкл буфера Е, 3 раза повторяется центрифугированием при 14000Xg в течение 3 мин. Добавить 3 мкл 10X эндо буфера реакции H и 1,5 мкл фермента эндо Н микроконтроллер ретентат, и выдержать в течение 3 часов при 37 ° C. Выпустила гликанов элюируют деионизированной водой на 3 повторяется центрифугирования, как в шаге 16.
- При желании, retentates от шагов, 16 и 17, содержащие эндо-Н-стойкие гликопротеины затем инкубировали с 200mU Н-гликозидазы F в 15 мкл буфера C, при 37 ° С в течение 16 часов Элюирование деионизированной воды производится как в шаге 16.
- Место трубки, содержащей реакции эндо H проточные (шаги 16 и 17) в SpeedVac концентратор, И сухие образцы полностью (это может быть сделано до 45 ° С, чтобы ускорить этот процесс).
- Для подготовки образцов для ВЭЖХ, ресуспендируют сухих гранул в 12 мкл ВЭЖХ растворитель (ацетонитрил: вода, 60:40, 1% фосфорная кислота).
- Настройка устройства высокоэффективной жидкостной хроматографии (связанный с колонки Spherisorb) на постоянный поток растворителя (1 мл / мин) и давления (особенно в диапазоне от 1000 до 2000 фунтов на квадратный дюйм), и место фракция коллектор менять трубки раз в 1 минуту.
- Нагрузка образцов в устройстве ВЭЖХ и начать фракция коллектор одновременно.
- Сбор 48 фракций по 1 мл из каждого образца бежать и бежать от стандартного олигосахарид смеси.
- Передача 500 мкл из каждой фракции сцинтилляционный флакон, и смешать содержимое с 3 мл воды смешивается сцинтилляционные жидкости.
- Нагрузка флаконов и читать в сцинтилляционных счетчиков.
- Считывания копий в минуту строится как функция от номера фракции.
- Копий в минуту значений в пределах пике представляют конкретные виды гликана следующим образом: фракции 18-21 соответствуют M5, фракции 22-26 на M6, фракции 27-31 по М7, фракции 32-35 до М8, фракции 36-39 до M9, Фракции 40-42 до G1M9 и фракций 43-45 до G2M9.
- Сумма копий в минуту значения для фракций внутри каждого пика отражает абсолютное количество конкретных видов гликана. Для того, чтобы компенсировать тот факт, что виды, содержащие более маннозы остатков приобрести больше лейбла, "относительное молярное количество" каждого вида гликана рассчитывается следующим образом: абсолютное количество каждого вида гликана делится на количество остатков маннозы, что он содержит . Это значение затем делится на сумму относительной молярной количества всех видов гликана получены для получения "процента от общего числа" для каждого конкретного вида гликана.
| Чейз (ч) | 0 | 4 |
| Год выхода с эндо H (CPM) | 90000 | 16800 |
| Год выхода с N-гликозидазы F (CPM) б | 20400 | 3900 |
| Гликопротеины в ретентат (копий в минуту) с | 371700 | 127695 |
| Долихола-олигосахариды в ретентат (CPM) г | 4350 | 540 |
| Долихола-олигосахариды в ретентат (%) е | 1,4 ± 0,7 | 0,2 ± 0,2 |
Таблица 1. Анализ выпуска N-связанных цепей с сахаром deglycosidases и наличие долихола-олигосахариды в гликопротеин образцов.
Мы применили импульсно-погони процедуру лизат из NIH 3T3. После фильтрации микроконтроллер, обозначенные N-связанных олигосахаридов были освобождены основном эндо H после импульса маркировки (высокая маннозы типа), и при дальнейшем лечении N-гликозидазы F после погони период, который соответствовал бы сложным типом (Гольджи обработанных гликанов), эндо Н устойчивы олигосахаридов. Этот количественный анализ установил, что долихола-олигосахариды, приходится незначительная часть этикетки в начальной ретентат.
Примечания:
- NIH 3T3 клетки помечены импульса [2 - 3 H] маннозы и преследовали с полной среде. После лизиса клетки и фильтрации через микроконтроллер YM30, высокая маннозы N-связанных олигосахаридов были освобождены из retentates путем инкубации с эндо H.
- Эндо H-стойкого материала в микроконтроллер retentates из (а) инкубировали с N-гликозидазы F и выпустила олигосахариды измеряется в сцинтилляционных счетчиков.
- Микроконтроллер retentates получается, как в (а) до начала лечения эндо H, были извлечены 4 раза хлороформ: метанол: вода 10:10:03 удалить предшественником гликолипиды и unextracted материал растворяли в 1N NaOH и подсчитывали в сцинтилляционных счетчиков.
- Долихола-олигосахариды очищали из экстрактов из (в), как описано в 1 и учитывается в сцинтилляционных счетчиков.
- Средняя из 3 экспериментов процентов долихола-олигосахариды (г) от общего числа копий в минуту в ретентат (C + D).
Представитель Результаты
Рисунок 1. Импульсно-погони анализ общего NIH 3T3 гликопротеины в необработанных клетках и на ингибирование протеасом После 1h импульсно-маркировки. [2 - 3 H] мы получили ожидаемый профиль с некоторыми glucosylatedпрекурсоров остальные (Glc 2 Man 9 GlcNAc 2 (G2M9) и G1M9), но большинство из этикетке присутствует в M9 и M8 видов, причем последний результат обрезки всех глюкозы и один остаток маннозы (рис. 1). Нет свободной маннозы или других мелких предшественников было обнаружено, что свидетельствует о тщательности очистки. После довольно долгого 8h погони был более обширным обрезки для M7-6 и небольшое количество M5, но основные виды прежнему M9 и M8 (рис. 1 б). Если погони было сделано в присутствии ингибитора протеасом (30 мкМ MG-132), было лишь незначительное накопление этих же обрезается видов (рис. 1 С).
Рисунок 2. Количественный анализ сахара цепи Erad подложке по сравнению с общим гликопротеинов. () В эксперименте похож на один из рисунка 1, относительной молярной количество каждого вида олигосахаридов, были рассчитаны по маннозы содержания. Мы преобразованы копий в минуту значения, полученные для каждого гликана видов, процент каждого вида по отношению к общей сумме относительной молярной количества всех видов, присутствующих был тогда на графике как функция времени для погони среднем два эксперимента. (B) Аналогичные к (А) кроме того, что гликанов освобожден от подложки Erad ASGPR Н2а были проанализированы после импульса маркировки и погони на срок до 4 часов, в наличии или отсутствии ингибиторов протеасомной MG-132. (С) значения в течение 4 часов погони в присутствии МГ-132 от (А) и (Б) сравниваются для ASGPR Н2а и гликопротеин бассейн. (D) Схема N-связанные сахара цепи обрезки процессов в ER. Сахар обрезки процессы, приводящие к M6-5 связаны с белками (R), которые ориентированы на Erad по сравнению с M9-8 на те, что выход на Гольджи и за его пределами. Результаты показывают, что Erad процесс связан с маннозы отделки N-гликанов для получения вида с 5-6 остатков маннозы осталось.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Импульсно-погони анализ гликанов в живых клетках с разделением ВЭЖХ обеспечивает метод для изучения динамики олигосахарид структурных изменений на протяжении всей жизни гликопротеин. Существует все больше доказательств, что такие изменения являются участвующих в производстве сигналы ER складывающиеся, контроля качества и 2-5 оборота системы. Метод может быть применен не только для конкретных гликопротеином интерес, но и для анализа динамики структуры от общего числа гликопротеины, как показано в этой статье, где мы сравнили контрастные судьбы конкретных субстрата Erad и клеточной бассейн гликопротеин . Очистка техника проста, но, тем не менее конкретны. С помощью строгой deglycosidases и молекулярной фильтрации гарантируется, что только N-связанных гликанов освобожден из гликопротеинов получаются, оставив позади других макромолекул, меченных [2 - 3 H] Человек, например, О-связанных цепей и сахар GPI-якорь белков. Олигосахариды освобожден из долихола предшественники незначительное загрязнение (табл. 1).
Метод обеспечивает высокую чувствительность обнаружения с использованием очень небольшого количества исходного материала. Когда ожидается очень низкий выход, чувствительность может быть увеличена за счет сокращения объема фракций ВЭЖХ использованием SpeedVac. Таким образом, растворимость ограничение сцинтилляционной жидкости могут быть преодолены, и все содержание фракций можно наблюдать в сцинтилляционных счетчиков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим Zehavit Френкеля и Сандра Толчинский для оказания технической помощи. Исследования, связанные с этим Работа выполнена при поддержке грантов от Израиля научного фонда (1229/07) и германо-израильского проекта сотрудничества (DIP-DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600E Multisolvent delivery System controller | Waters | WAT062710 | |
| Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography) | Merck & Co., Inc. | 1.0003 | |
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30 | EMD Millipore | UFC503024 or 4208 | |
| Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor | Eppendorf | 5301 000.016 | |
| Dialyzed F–tal Calf Serum | Biological Industries | 04-011-1A | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | GIBCO, by Life Technologies | 41965039 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - glucose free | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| EDTA disodium salt(Titriplex Iii) | Merck & Co., Inc. | 1084180250 | |
| Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml) | New England Biolabs | p0703S | |
| F–tal Calf Serum (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Frac-100 fraction collector | Amersham | 18-1000-77 | |
| LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems | Beckman Coulter Inc. | 510720 | |
| Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer, Inc. | NET570A | |
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | |
| N-glycosidase F (1000 units/ml) | Roche Group | 11365177 | |
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | |
| NIH 3T3 cells | American Type Culture Collection | CRL-1658 | |
| Opti-Flour | PerkinElmer, Inc. | 6013199 | |
| Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC) | Fluka | 79607 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Protein A-Sepharose beads | Repligen | IPA300 | |
| Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6 | |||
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | |
| Triton X-100 | VWR | 306324N | |
| Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | |
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside | |||
| NIH 3T3 stably expressing H2a 6 | |||
| Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate,0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercapt–thanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).
- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
- Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2. J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).
- Hosokawa, N. Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I. J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).
- Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure. J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).
- Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide. J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).
