Summary
Biz embriyogenez sırasında canlı görüntüleme hücresel davranışı için kimerik zebrafish embriyolar üretmek için bir protokol ortaya koymaktadır.
Abstract
Hücreler embriyogenez sırasında konumlarını ve mal yaygın olarak değişir. Bu değişiklikler hücre ve çevreleri arasındaki etkileşimler tarafından düzenlenir. Farklı genetik arka plan hücreleri oluşur Kimerik embriyolar, genler tarafından ilgi aracılı hücre-hücre etkileşimleri çalışmak için mükemmel araçlardır. Erken gelişim aşamasında zebrafish embriyonik şeffaflık, hücresel düzeyde, doku ve organların morfolojilerinden doğrudan görselleştirme izin verir. Burada, zebrafish embriyolar kimerik retina ve beyin oluşturmak ve donör hücreleri canlı görüntüleme gerçekleştirmek için bir protokol göstermektedir. Protokol nakli iğneler, nakli hazırlık kapsar GFP ifade GFP-negatif ana donör blastomer ve canlı konfokal mikroskobu altında donör hücre davranışlarının incelenmesi. Hafif değişiklikler, bu protokolü de embriyonik gelişim zebrafish diğer doku ve organları incelemek için kullanılan olabilir. Etiket donör hücreleri GFP kullanmanın avantajları da tartışılır.
Protocol
1. Gün. Hazırlık
1. Balık haçlar
Akşam zebrafish ikili haç ayarlayın. Istenilen süre önce rastgele çiftleşme önlemek için, kadın ve erkek balık çiftleşme kasetleri ayrı bölücüler kullanın. GFP ifade transgenik balık donör blastomer kaynağı olarak kullanılır. Pt104 transgenik hattı (Zou ve ark, 2008), burada kullanılan EF1 promotör kontrolü altında yayg GFP ifade eder. GFP ifade donör hücreleri canlı görüntüleme görselleştirme sağlar. Uygun floresan proteinleri ifade transgenik balık hatları belirli ihtiyaçları için kullanılıyor olabilir.
2. Embriyo tutmak için kama şeklindeki agaroz kuyuları hazırlayın
E3 yumurta su (Westerfield 2007) hazırlanan erimiş% 1 agaroz, bir Petri kabı içine dökün. Agaroz çözüm kama şeklinde çıkıntılar vardır ve agaroz çözümü tamamen katılaşmaya plastik bir kalıp Float. Kalıp dikkatlice çıkarın ve E3 su ile agaroz yatak batırmayın.
3. Transplantasyonu iğneler hazırlayın
Cam kapiller pipetler (Dünya Hassas Çalgı) çekerek iğne yapmak 11,5 ayar güçte bir dikey İğne çektirmesi (David Kopf Aletleri) kullanın. İyi iğne uçları, uzun miller ile konik olmalıdır. , Iç çapı 40-45μm Eğimli açıklıkları (Şekil 1A) elde edilir kadar Micro Öğütücü (Marishige) ile 45 derecelik bir açıyla iğne uçları Grind. Iğne uçları temizlemek için, iğne künt ucu bir hortum takmak, bir şırınga hortum bağlayın ve sonra emmek ve tüm görünür enkaz çıkarılana kadar% 10 hidroflorik asit çözeltisi bırakın. Daha sonra,% 100 etanol ile takip ipuçları, saf su ile yıkayın. Tüm etanol buharlaşır kadar iğne Hava kurulayın. Artık etanol yüksek sıcaklık parlatma adımı sırasında iğne berbat: ipuçları tamamen kuru olduğundan emin olmak için çok önemlidir. Iğne uçları pürüzlü kenarlarını yumuşatmak ve parlatmak için, iğne uçları filament Micro Forger (Marishige) tarafından üretilen ısı ile pişirin. Iğne uçları parlatma sırasında filament dokunmasına izin vermeyin. Filament iplik ve iğne uçları arasındaki mesafe olsa da geçen elektrik miktarı istenilen ısıtma koşullarını elde etmek için ayarlanabilir. Sıcaklığı çok yüksek olmamalıdır: Bu erime ve iğne uçları deforme olacaktır. Pürüzlü kenarlar düzeltilir sonra, dikkatli bir iğne ucu ile ısıtılan filaman dokunun ve sonra yavaşça iğne, sivri bir uç oluşturmak için (Şekil 1B) uzak filament çekin. , Keskin, pürüzsüz ve temiz bir iğne sağlam donör blastomer elde etmek için ve ev sahibi embriyolar zarar için kritik öneme sahiptir.
4. Bir embriyo konumlandırma prob hazırlayın
Düzeltilir bir ucu ile ince bir cam probu elde etmek için bir gaz alev üzerine cam bir pipet çekin. Bu prob önce nakli uygun yönlendirmeyi embriyoları yerleştirmek için kullanılır.
2. Gün. Blastomer nakli
1. Toplayın ve dechorionate embriyolar
Ertesi gün, arkadaşı balık izin çapraz kasetleri bölücüler çıkarın. E3 su ile dolu bir Petri kabındaki embriyoların yerleştirin. Daha sonra, ince forseps bir çift elle embriyoların chorions koparıp dechorionate embriyolar. Dikkatle agaroz kuyulara dechorionated embriyo transferine bükük şaft bir cam pipet kullanın. Embriyoların hava ile herhangi bir temastan kaçının, patlamaya embriyolar neden olur. Embriyolar 28.5 geliştirelim ° C agaroz kuyuları, 3 saat gübreleme, ya da hpf kadar.
2. Nakli aparat
Embriyoların geliştirirken, mineral yağ dolu mikro pompa sistemi transplantasyonu iğne bağlayarak nakli aparat kurdu. Sistem kaçak değildir ve herhangi bir hava kabarcığı sistem içinde sıkışıp kalırlar emin olun. Geri mineral yağ ile 0,5 hariç tüm nakli iğne doldurmak alan 1 ul ucu açılışında.
3. Blastomer Nakli
Blastomer nakli için, 3-4-hpf embriyoların blastomer tarafında yukarı doğru yönlendirmek amacıyla cam konumlandırma prob kullanın. Sonra, yavaşça bir donör embriyo nakli iğne yerleştirin ve yavaş yavaş iğne 5-20 blastomer emmek. Bir dizi embriyo içine blastomer dolu bir iğne takın ve blastomer yavaşça bırakın. Onların soyu daha sonra gelişim evreleri yerde lokalize blastomer yayımlanan site etkileyecektir. Retina ve beyin gelişimi, hayvan kutup hücreleri serbest analiz etmek. Nakli sırasında, iğne ucu hava teması olmadığından emin olun. Mekanik zararları en aza indirmek için, ev sahibi embriyolar ertesi güne kadar 28.5 ° C'de agaroz kuyularda sol olacaktır. Sonra, tHer iyi bir embriyo ile,% 1 agaroz 0.5 ml ile ön kaplı 24-kuyucuğu mozaik embriyolar ransfer. E3 yumurta su 1 ml her kuyuya eklenir. Bakteriyel enfeksiyonları önlemek için, 10 ul 100X penisilin ve streptomisin E3 yumurta su ekleyin.
3. Gün. Gömme ve mozaik embriyoların canlı görüntüleme
1. Gömülmesi embriyolar
E3 yumurta suda% 1.5 düşük erime noktası agaroz (LMP) hazırlayın ve 30 ° C su banyosunda çözüm tutmak. 0.17mm kalınlığında bir cam alt FluoroDish doku kültürü çanak (Dünya Hassas Aletler) bir mozaik embriyo transferi. E3 asgari bir miktarı kapsadığı embriyo bırakmak aşırı E3 suyu çıkarın. Embriyo 30-50 ul erimiş% 1.5 LMP ekleyin. Agaroz çözüm katılaşır önce cam dibine mümkün olduğunca yakın olarak göz veya beyin hızla yerleştirin. Çözüm soğuduktan sonra, embriyolar daha yerinde sabitlemek için ek agaroz çözüm ekleyin. Daha sonra, 2-3 ml E3 yumurta su ile katılaşmış agaroz blok bırakın.
2. Konfokal Görüntüleme
Konfokal mikroskopi için, büyük odak derinliği ile su daldırma ters objektif (Olympus, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, Japonya) kullanılır. Amaç üzerine bir damla su eklenir ve daha sonra objektif bir FluoroDish doku kültürü çanak yerdir. Görüntü geliştirme için, embriyoların her 5 dakikada bir fotoğraf çekmeye zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirin. Deney doğasına bağlı olarak, çekimler arasında zaman aralıkları ayarlanabilir olmalıdır.
Temsilcisi sonuçları
Şekil 2 temsilcisi, 24-hpf mozaik zebrafish göstermektedir. GFP ifade yeşil donör hücreleri vurgulamaktadır. Retina nöroepitelyal hücrelerin tüm retina duvar kalınlığı kapsar.
Film 24 hpf ev sahibi beyin donör hücreleri hareketlerini gösterir. Bildirimi hücrelerinin morfolojileri zamanla değişir.
Şekil 1 nakli iğne uçları Şekilleri. A., bir iğne ucu kesik bir açılış hidroflorik asit yıkar sonra enkaz serbest bırakıldı. B. iğne ucunda sivri ucunu oluşturulmuştur.
Şekil 2 Görselleştirme GFP-24 hpf kimerik zebrafish embriyolar donör hücreleri ifade. Sol panelinde, beyin ve retina GFP sinyalleri gösterir. Orta panel, parlak bir alan resim embriyo. Sağ panelde Birleştirilen görüntüyü gösterir.
Film 1 GFP pozitif donör hücreleri görüntüleme, beyin nöroepitelyal hücrelerinin gelişimi sırasında morfolojileri kapsamlı değişiklikler gösterdi Canlı . 24 ve 25 hpf arasında her 5 dakikada bir filmin kareleri tek tek toplandı. film görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu video, blastomer nakli zebrafish retina ve beyin gelişimini analiz etmek için bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu protokol aynı zamanda ilgili yerlere sadece ev sahibi embriyolar donör blastomer bırakmadan diğer doku ve organların gelişimini analiz etmek için kullanılabilir. GFP molekülleri ile etiketleme, floresan boya konjuge Dextran'ın (Ho ve Kane 1990) ile etiketleme daha temiz bir arka plan verir. Bu ölü donör hücreleri Dextran'ın boyaların enkaz böylece görüntüleme (Catalano ve ark, 2007) ile çıkarım, GFP daha uzun sürer çünkü. Buna ek olarak, GFP pozitif donör hücreleri Dextran'ın boyalar içeren bu daha sağlıklı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Erişmiş R01EY016099 ve Araştırma Körlük Kariyer Geliştirme Ödülü Engellenir: Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) Çekirdek Grant (5P30EY008098) ve aşağıdaki fonlar XW tarafından desteklenmiştir. Kira Lathrop konfokal görüntüleme yardım için teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ¾" Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| FluoroDish | World Precision Instruments, Inc. | FD35 | |
| Vertical Needle / pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Micro Grinder | Marishige | EG-400 | |
| Micro Forge | Marishige | MF-830 | |
| Manual Microsyringe Pump | World Precision Instruments, Inc. | MMP | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11232-20 | |
| Hydrofluoric Acid | Fisher Scientific | A147-1 | |
| Penicillin- Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Agarose | Research Products International Corp. | 9012-36-6 | |
| Low melting agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
E3 egg water:
|
|||
|
|||
|
|||
References
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
- Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).
