Summary
Мы демонстрируем протокол для получения химерных эмбрионов данио для живого изображения сотовой поведение во время эмбриогенеза.
Abstract
Клетки изменения широко в местах их расположения и имущества во время эмбриогенеза. Эти изменения регулируется взаимодействие между клетками и окружающей их среды. Химерные эмбрионы, которые состоят из клеток разных генетический фон, большие средства для изучения межклеточных взаимодействий посредничестве генов, представляющих интерес. Эмбриональных прозрачности данио на ранних стадиях развития позволяет прямой визуализации морфогенез тканей и органов на клеточном уровне. Здесь мы демонстрируем протокол для получения химерных сетчатку и мозг в данио эмбрионов и выступать с концертами изображений донорских клеток. Протокол охватывает подготовку трансплантации иглы, трансплантации GFP-экспрессирующих доноров бластомеров на GFP-отрицательный Саваоф, и изучение клетки-донора поведения в живых конфокальной микроскопии. С небольшими изменениями, этот протокол также может быть использован для изучения эмбрионального развития других тканей и органов в данио. Преимущества использования GFP в клетки донора этикетке также обсуждаются.
Protocol
День 1. Подготовка
1. Настройка рыбы кресты
Настройка попарно кресты данио в вечернее время. Для предотвращения случайного скрещивания до нужного времени, используйте циркуль, чтобы отдельные женские и мужские рыбы в брачный кассет. GFP-экспрессирующих трансгенных рыб используются в качестве источника донорских бластомеров. Pt104 трансгенные линии (Цзоу и соавт., 2008), используемый здесь, выражает GFP повсеместно под контролем EF1 промоутера. GFP выражение позволяет визуализировать донорских клеток живыми изображениями. Другие трансгенных линий рыбы, которые выражают подходящий флуоресцентные белки могут быть использованы для конкретных потребностей.
2. Подготовка клиновидный агарозном скважин для проведения эмбриона
Залить расплавленный 1% агарозы, подготовленный в E3 воды яйцо (Уэстерфилд, 2007), в чашку Петри. Float пластиковых форм, которые клиновидные выступы на решение агарозы и пусть решение агарозном полностью затвердеть. Удалить плесень тщательно и погрузиться кровать агарозы с E3 воды.
3. Подготовка трансплантации иглы
Использование вертикального съемник иглы (David KOPF Instruments) на параметры питания 11,5 сделать иглы, потянув стеклянный капилляр пипетки (Инструмент Всемирной Precision). Хорошие советы игла должна конус с длинными валами. Grind иглы советы в 45-градусный угол с Micro Grinder (Marishige) до скошенными отверстия 40-45 мкм с внутренним диаметром получаются (рис. 1А). Для очистки иглы советы, прикрепить шланг, чтобы тупой конец иглы, подключить шланг к шприц, а затем поглощать и выпуска 10% раствор плавиковой кислоты, пока все видимые мусор удаляется. Затем вымыть советы с дистиллированной водой, а затем 100% этанола. Воздух сухой иглы, пока все этанола испаряется. Важно обеспечить, чтобы советы абсолютно сухие: остаточная этанола погубит иглы во время высокотемпературных полировки шагом. Чтобы смягчить и польский острые углы иглы советы, испечь иглу советы с тепла нити Micro кузнец (Marishige). Не позволяйте иглы советы касаются нити во время полировки. Количество электроэнергии, проходящие через нить накала, а расстояние между нитью и иглой советы могут быть скорректированы для достижения желаемых условий отопления. Температура не должна быть слишком высокой: это будет таять и деформировать иглу советы. После грубой края сглаживается, осторожно прикасаться нагревается нить с иглой, а затем осторожно потяните нить от иглы для генерации заостренным концом (рис. 1В). Острые, гладкие и чистые иглы имеет решающее значение для получения нетронутыми бластомеров доноров и не повреждая хост эмбрионов.
4. Подготовка эмбриона позиционирования зонда
Вытащите стеклянную пипетку за газового пламени для получения тонкой зонд стекла с сглаживается конца. Этот зонд будет использоваться для размещения эмбрионов в правильной ориентации перед трансплантацией.
День 2. Бластомер трансплантации
1. Сбор и dechorionate эмбрионов
На следующий день, удаление разделителей в кросс кассеты, чтобы рыба для спаривания. Место эмбрионов в чашке Петри заполнены E3 воды. Затем, dechorionate эмбрионов вручную отторжения chorions из эмбрионов с парой тонких щипцов. Используйте стеклянную пипетку с коленчатого вала тщательно передачи dechorionated эмбрионов в агарозном скважин. Избегайте любого контакта эмбрионов с воздуха, которые вызывают эмбрионов до их разрыва. Пусть эмбрионы развиваются в 28,5 ° С в агарозном скважин до 3 часов после оплодотворения, или HPF.
2. Настройка аппарата трансплантации
В то время как эмбрионы развиваются, создана трансплантации аппарата, подключив иглы трансплантации минеральных маслонаполненных микро-насосной системы. Убедитесь, что система не протекает и не быть пузырьков воздуха в системе. Вернуться заполнить весь иглы трансплантации с минеральным маслом, за исключением 0,5 - 1 мкл пространства на кончике открытия.
3. Трансплантация бластомеров
Для пересадки бластомеров, используйте зонд стекла позиционирования ориентироваться бластомеров сторону 3-4-HPF эмбрионов вверх. Затем, аккуратно иглу трансплантации эмбрионов доноров и медленно поглощать 5-20 бластомеров в иглу. Вставьте бластомеров заполненные иглу в хост эмбриона и отпустите бластомеров медленно. Сайт, на котором бластомеры выпустила будет влиять, где их потомства локализовать на более поздних стадиях развития. Для анализа сетчатки и мозга Разработка, выпуск клеток животных полюса. При пересадке, убедитесь, что иглы не свяжется с воздуха. Чтобы свести к минимуму механических повреждений, принимающих эмбрионы должны быть оставлены в агарозном скважин на 28,5 ° С до следующего дня. Затем, тransfer мозаики эмбрионов на 24-луночных предварительно покрытых с 0,5 мл 1% агарозы, с одним эмбрионом в каждую лунку. 1 мл воды E3 яйцо добавляли в каждую лунку. Для предотвращения бактериальных инфекций, добавить 10 мкл 100X пенициллина и стрептомицина на E3 воды яйцо.
День 3. Вложения и жить изображений мозаичного эмбрионов
1. Вложение эмбрионов
Подготовка 1,5% низкой температурой плавления агарозы (LMP) в Е3 воды яйцо и держать раствор в 30 ° С водяной бане. Передача мозаики эмбриона FluoroDish блюдо культуры ткани со стеклянным дном из 0.17mm по толщине (инструменты Всемирного Precision). Удалите излишки воды E3 оставить эмбриона только покрыта минимальное количество Е3. Добавить 30-50 мкл расплавленного 1,5% LMP для эмбриона. Быстро положение глаз или мозг как можно ближе к стеклянным дном, как возможно, прежде чем решение агарозном затвердевает. После того как раствор остынет, добавить дополнительные решения агарозном дальнейшего безопасного эмбрионов на месте. Затем погрузите затвердевшей агарозы блок с 2-3 мл воды яйцо Е3.
2. Конфокальной микроскопии
Для конфокальной микроскопии, воды погружения перевернутой цели (Olympus, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, Япония) с большой глубиной фокусировки производится. Капля воды добавляется на цель, а затем поместить FluoroDish блюдо культуры ткани на цель. Чтобы создать образ развития, выполнения покадровой изображений по съемке эмбрионов каждые 5 минут. В зависимости от характера экспериментов, интервалы времени между кадрами должна быть скорректирована.
Представитель результаты
На рисунке 2 показано представитель 24-HPF мозаики рыбок данио. GFP выражение подчеркивает донорских клеток в зеленый цвет. Сетчатки нейроэпителиальные клетки охватывают всю толщу сетчатки стене.
В фильме показана движения донорских клеток в принимающей мозга на 24 HPF. Обратите внимание, морфологией клетки со временем меняются.
Рисунок 1. Формы советы трансплантации иглы. А. скошенными открытие кончик иглы был свободен от мусора после плавиковой кислоты моет. Б. острый конец был сгенерирован на кончике иглы.
Рисунок 2. Визуализация GFP-экспрессирующих донорских клеток в химерных эмбрионов данио на 24 HPF. Левая панель показывает GFP сигналов в мозг и сетчатку. Панель средний яркая картинка области эмбриона. Правая панель показывает объединенного изображения.
Фильм 1. Живая съемка GFP-положительных клеток доноров продемонстрировали значительные изменения в морфологии мозга нейроэпителиальных клеток в процессе развития. Отдельные кадры из фильма собирались каждые 5 минут между 24 и 25 HPF. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом видео мы продемонстрируем метод трансплантации бластомеров проанализировать сетчатки и развитие мозга в данио. Этот протокол также может быть использована для анализа развития других тканей и органов просто выпуская доноров бластомеров в соответствующих местах в принимающей эмбрионов. Маркировки с GFP молекул дает более чистый фон, чем маркировка с флуоресцентным красителем-сопряженных декстрана (Ho и Kane, 1990). Это потому, что мусор красителей Декстран от мертвых клеток донора длится намного дольше, чем GFP, таким образом, выведение с томография (Каталано и соавт., 2007). Кроме того, GFP-положительных клеток донора, более здоровы, чем те, которые содержат декстран красителей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальным институтом здоровья (NIH) Core Грант (5P30EY008098) и следующие средства для XW: NIH Грант R01EY016099 и исследований в области профилактики слепоты развития карьеры Award. Мы благодарим Кира Латроп за помощь в конфокальной микроскопии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ¾" Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| FluoroDish | World Precision Instruments, Inc. | FD35 | |
| Vertical Needle / pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Micro Grinder | Marishige | EG-400 | |
| Micro Forge | Marishige | MF-830 | |
| Manual Microsyringe Pump | World Precision Instruments, Inc. | MMP | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11232-20 | |
| Hydrofluoric Acid | Fisher Scientific | A147-1 | |
| Penicillin- Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Agarose | Research Products International Corp. | 9012-36-6 | |
| Low melting agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
E3 egg water:
|
|||
|
|||
|
|||
References
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
- Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).
