ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長のビデオバイオインフォマティクス解析

Summary

ビデオバイオインフォマティクスは、自動処理、分析、理解、および顕微鏡ビデオから抽出した生物学的な時空間データのデータマイニングです。この記事の目的は、ビデオバイオインフォマティクスの手法を用いて、ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長を測定するための方法を示すことです。

Abstract

ビデオデータは複雑であり、多くの画像、ビデオ素材からマイニング情報で構成されているため、コンピュータソフトウェアの助けなしに行うことは困難です。ビデオバイオインフォマティクスは、デートマイニングと分析を実行するコンピュータソフトウェアを使用してビデオ画像からの時空間データを抽出するための強力な定量的なアプローチです。この記事では、我々には、ビデオ画像のためのカメラを搭載したニコンBioStation CTインキュベーターで収集したタイムラプスビデオを分析することにより、ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）の成長を定量化するためのビデオバイオインフォマティクスの手法を紹介する。我々の実験では、マトリゲルにアタッチされていたヒトES細胞のコロニーは、BioStation CTで48時間撮影されました。これらのコロニーの成長率を決定するために、レシピは、ユーザーがビデオ画像からのデータの様々なタイプを抽出することができるCL -クワントソフトウェアを使用して開発されました。正確にコロニーの成長を評価するために、3つのレシピを作成しました。植民地と背景、正確にビデオシーケンス全体にコロニーを定義する2番目の拡張像、およびサードへの最初のセグメント化された画像は、時間をかけて植民地でピクセル数を測定した。 3つのレシピが48時間にわたって個々のヒトES細胞のコロニーの成長率を分析するBioStation CTで収集した映像データを順番に実行されました。 CL -クワントレシピの真実性を確認するには、同じデータをAdobe Photoshopソフトウェアを使用して手動で分析した。データは、CL -クワントのレシピを用いて得られたし、Photoshopを比較したところ、結果はCL -クワントレシピが真実であったことを示す、実質的に同一であった。ここで説明する方法は、ヒトES細胞やコロニーに成長する他の細胞の増殖率を測定するために任意のビデオデータに適用することができる。さらに、他のビデオバイオインフォマティクスのレシピは、マイグレーション、アポトーシス、および細胞接着などの他の細胞プロセスのための将来的に開発することができます。

Protocol

その1：実験方法

ビデオデータは、情報の豊富さが含まれています。しかし、この情報は頻繁に抽出することは困難であると人間が手作業で行われ、完了するスタッフの時間の多くの時間を必要とする可能性がある場合。人間による手動の分析はまた、解釈し、エラーの変化の対象となります。ビデオバイオインフォマティクスは、ビデオ画像から特定のデータをマイニングするためのコンピュータソフトウェアの使用を含む。分析のこの方法は迅速であり、分析は人間が手作業で行われている場合に発生するエラーを排除することができます。この記事の目的は、ビデオバイオインフォマティクスの手法を用いて、ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長を定量化する方法を示すことです。

本論文では、時間経過のビデオ画像は、細胞の複数のフィールドが（図1）時間をかけて撮像を可能にするニコンBioStation CTのインキュベーションのユニットを使用して収集した。このレポートで説明されている方法は、設定微細な任意のビデオによって収集された映像データに適用可能である。

48時間、12ウェル組織培養プレートでH9 hESCの我々の実験デザインで、私たちはメッキ。このインターバルの間に、コロニーを完全に接続し、マトリゲル上に展開させた。その後、添付されたヒトES細胞のコロニーとプレートBioStation CTに転送し、さらに48時間インキュベートした。 BioStationにしながら、コロニーの画像は7分間隔で採取し、後でタイムラプスビデオシーケンスを作成するために使用されていました。各コロニーのためのビデオは、CL -クワントソフトウェアで開発したビデオバイオインフォマティクスのレシピを使用してコロニーの成長を定量化するために分析した。 CL -クワントソフトウェアで作成されたレシピを使用して行う分析は、手動でAdobe Photoshopを使用して真実性について調べた。

パート2：添付されたヒトES細胞のコロニーの準備

1. マトリゲルでコートした6ウェルプレートにヒトES細胞の成長、そして一度、70％コンフルエントに達すると、次のように12ウェルマトリゲルコーティングしたプレートの5ウエルに6ウェルプレートの1つのウェルをreplate。
2. よく含まれているヒトES細胞から培地を吸引除去する。
3. PBS 1mlのと2倍よくすすいでください。
4. 37℃および5％CO _2を 1分間Accutaseとインキュベートの1ミリリットルを追加。
5. ウェルに10月12日ガラスビーズを追加し、コロニーは完全にウェルの底からデタッチされるまで静かにプレートを振る。
6. mTeSR培地またはMEF馴化培地1mlを使用してAccutaseを中和する。
7. 3分間200グラムで15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液を遠心してください。
8. 新鮮mTeSR媒体の500μLで上清とブレークペレットをデカント。
9. 12ウェルプレートの各ウェルにhESCのサスペンションのプレートの滴下100μlの。
10. ロックプレートは前後に軽くし、光学顕微鏡下での文化を観察。細胞塊は均等にプレート全体に分散されていることを確認します。
11. バックインキュベーターに12ウェルプレートを置きます。
12. ヒトES細胞を48時間装着し、成長することができます（より短い時間を使用することができる）。
13. 48時間後、培地をデカントし、アタッチされていない細胞を除去するためにPBSの500ulでウェルを洗浄。
14. 各ウェルにmTeSRの培地を1mlを追加。
15. コメント：直ちにインキュベーター/ビデオイメージングのための顕微鏡にプレートを置く。
16. タイムラプス画像の収集を開始。他のコロニーに成長する可能性がない離散単一のコロニーを持つフィールドを選択しよう。
17. 培養してヒトES細胞をセットアップするための他の方法は、上記のプロトコルの代わりに使用することができます。

パート3：ビデオバイオインフォマティクス

CL -クワントのソフトウェアは、順番に実行するときに時間をかけて各コロニーに対してミクロンのピクセル数または領域を決定する三つの"レシピ"を作成するために使用されました。 3つのレシピは順番に、このアプリケーション用に構築されているセグメンテーション、強化、および測定を含む。

CL -クワントソフトウェア/レシピの開発を使用してhESCのコロニーの成長の分析：

1. セグメンテーションのレシピが最初に作成されます。
2. ビデオが使用可能であることを確認してビデオ全体をスキャンします。コロニー全体が視野に残っていると他のコロニーはフィールドを入力しないことを確かめるためにチェックします。
3. セグメンテーションウィザードを開き、"次へ"ボタンをクリックしてください。
4. 正しいイメージのチャンネルを（すなわち、位相、緑、赤、など）を選択し、"次へ"ボタンをクリックしてください。
5. 3つの選択肢のうち"ソフトなマッチング"を選択し、"次"をクリックします。
6. 一般的に画像コロニーの中央部に植民地の外縁上の領域を周回することによって"希望"の領域を選択します。
   • この領域はできるだけ小さくする必要がありますが、全体の植民地の代表です。
   • 位相差顕微鏡を使用する場合、ソフトによって正確なコロニーを選択するためのコロニーの周囲にハローを含めるようにしてください。
   • 異なる表示される場合があります関心の1または2の地域を選ぶピクセルは、コロニー内のパターンが、不正確なマスクのアプリケーションにつながる可能性が多すぎる"欲求"を選択しないでください。
7. "次へ"ボタンをクリックします。
8. 植民地ではなく背景の部分の一部ではない画像上の領域を周回することで地域を"希望しない"を選択します。これらはあなたが抑制し、そのような残骸や死細胞などのアーティファクトのピクセルを含むようにしたいパターンを持っている領域です。 "次"をクリックします。
9. あなたが抑制したい領域を周回することで"背景"を選択します。
   • "したくない"と"背景"地域がそのバックグラウンドが異なる均一とすべてのフレームに表示する可能性が高いはずです。
   • 一般的に我々は、コロニーの周りの灰色の背景を選択します。
10. "次へ"ボタンをクリックします。
11. 色付きのマスクは、興味のある領域（図2A）上に表示されるべきである。
12. マスクは、正確に興味のある領域をカバーしていない場合、セグメントのしきい値の範囲は、（ソフトウェアの画面の右下にある）に増加または減少させることもできます。
13. 必要に応じて、セグメンテーションウィザードはさらにマスク領域を微調整するプロンプトが表示されます。
14. あなたがマスクを変更したい場合、"ソフトのマッチング領域を更新する"を選択します。これは、"したくない"、"する"、または"背景"の領域を変更することができます。
15. マスクが十分な場合には、"しきい値を適用し、私のマスクを保存"を選択し、"次へ"ボタンをクリックしてください。
16. マスクは、異なる色で表示されます。
17. "フィニッシュ"を選択します。
18. レシピは、ソフトウェアの右上隅に表示されるべきである、そしてそれが"セグメンテーションのレシピ"と呼ばれるべきものです。
19. あなたが右クリックし"名前の変更"で希望の場合レシピの名前を変更します。
20. スポットチェック用に、右クリックし、"レシピを適用"の上にマウスを置きます。
21. メニューでは、スポットのレシピをチェックするときに使用したいフレーム数を選択できるようにすることが表示されます。マスクの位置の精度を確認発見するごとに10フレームのためのレシピを実行します。
22. マスクは、小さな不要な領域または破片の部分をピックアップすると、関心の領域にマスクのフィッティングを改善するために"強化のレシピ"を作成することができます。
23. 強化のレシピを作成するには、右の"強化のレシピ"フォルダをクリックし、"新しい"をクリックしてください。新しい拡張のレシピが表示されるはずです。
24. 視野（FOV）の元のフィールドから、画像の右側にある"トグルの拡張モジュール"ボタンをクリックしてください。正しいものを識別するために、ツールバーのアイコン上にマウスを移動します。
25. "ラベル表示"ドロップダウンメニューを選択してください。
26. "ラベリング4接続"を選択します。
27. "ラベリング4 connected2"を選択します。
28. 新しいタスクバーが表示されるはずです。
29. セグメンテーションのレシピから、初期マスク（mask0）を取得し、"入力"ボックスにドラッグします。
30. バーが"＃入力のマスクを"表示する必要があります。
31. マスク0アイコンに"＃入力マスク"でアイコンをドラッグします。
32. タスクバーの"最小サイズ"を見つけ、関心領域のみが表示されるまで数を調整します。あなたが各継手の試験を通じて、"実行"をクリックすることを確認してください。
33. 一旦あなたがあなたの最小サイズの調整に満足している、以前に作成した"強化のレシピ"をクリックしてください。 （図2B）
34. 画面の下部に、"レシピに保存"を選択します。
35. ソフトウェアは、現在"選択されたレシピを上書き？"、"はい"を選択するプロンプトが表示されます
36. スポットチェックするセグメンテーションのため上記と同じ手順を使用して強化のレシピをチェック見つける。
37. セグメンテーションと強化のレシピに満足している場合、右側のツールバーにある" 測定のテンプレートを作成"を選択します。
38. 必要に応じてするテンプレートの名前を変更します。
39. 測定のテンプレート]ウィンドウで、クリップアートのセルの数字の上にカーソルを移動します。 Ctrlキーを押しながらセルを選択します。
40. チェックを外して"デフォルトパラメータ"と"形態"の下のチェック"の領域のパラメータ'。
41. "テンプレート"ウィンドウを終了します。
42. 測定のレシピで作成されたアイコンを選択します。
43. レシピの名前を変更します。
44. に移動し、右上隅にある"テンプレート"タブを選択します。
45. ドラッグして、測定ウィンドウにドラッグして、以前に作成した測定テンプレートをドロップします。
46. 続行するには"はい"をクリックします。
47. 測定レシピ]ウィンドウで、選択して"全細胞"、"チャンネルマッピング"。
48. SELECT'マスクのマッピング"。
49. その後、強化されたマスクのための"全セルのオプションを選択します。
50. メインウィンドウでレシピのタブの下にある"測定レシピ"を選択してください。
51. 測定レシピのウィンドウ内の"Save"アイコンを選択してください。
52. その後、ウィンドウを閉じます。
53. 今、"FOV"を閉じて開き直します。
54. 右の"レシピ"アイコンを選択"ロックのレシピのリスト"をクリックしてビデオデータを順番にレシピを実行する。

パート4：Photoshopのソフトウェアを使用して、レシピの正確さの確認

（CL -クワントソフで作成されたレシピを検証するために）は、同じデータをAdobe Photoshopで手動で解析することができます。この分析では、10回ごとのフレーム（毎70分の時点で）48時間以上のコロニーの大きさを測定するために分析した。

1. Adobe Photoshopでコロニーの画像のフレームを開きます。
2. ツールバーにある魔法の杖ツールをクリックしてください。
3. フィールド全体が植民地の地域を除いて覆われているように植民地の周辺をクリックしてください。
4. ツールバーの"はクイックマスクモードで編集"とコロニーが選択されているように植民地をクリックします。
5. コロニーの周囲に点線のラインは、コロニーの周辺部とではない、その中に右に収まることを確認してください。点線が周囲にない場合は、それに応じて上部のツールバーに許容値を変更します。
6. メニューをプルダウンし、"ヒストグラム"をクリック"ウィンドウ"に移動します。
7. ときにキャッシュ= 1ピクセルの値を書き留めます。キャッシュが2の場合は、クリックに'！'キャッシュを1に変更してから、ピクセルの値をメモする。
8. 10回ごとのフレームのため、上記プロセスを繰り返します。必要に応じて、より少ない合計フレームを使用することができます。
9. PhotoshopとCL -クワントソフトウェアを使用して収集されたデータは、一緒にプロットすることができます。 CL -クワントレシピが真実なら、PhotoshopとCL -クワント分析のための曲線は（図3-5）非常に似ている必要があります。
10. CL -クワントで開発したレシピが真実なら、彼らは確実に他のビデオデータに適用することができます。
11. この分析でビデオバイオインフォマティクスを使っての値は、セグメンテーション、強化、および測定のレシピを開発し、検証されれば、彼らははるかに急速に、より正確にPhotoshopを使用して、人間よりも解析が実行されるためです。

代表的な結果

図1：BioStation CTでの成長の48時間の間にさまざまなタイミングでフレームを示すhESCのコロニーのフィルムストリップ。フレームは、7分間隔で採取された。

図2：セグメンテーションのレシピによって植民地に置かれたマスクを使ってヒトES細胞の（A）イメージ。破片と背景の領域も強化レシピが評価の精度を向上させるために必要とされることを示すマスクされています。 （B）増強後の"A"に示すように、同じコロニーのイメージが実行されています。マスクは今だけ植民地を選択し、ノイズは選択から除外されています。

図3：CL -クワントソフトウェアとPhotoshopを使用して決定されるように48時間以上（ピクセル単位）コロニーの大きさの増加を示すグラフ。このグラフはコロニーがさまざまなサイズで起動することを生データとを示している。また、測定の両方の方法がよく一致していることを示しています。

図4：48時間以上のコロニーの大きさのパーセントの増加を示すために正規化した後、図3と同じデータを示すグラフ。これは成長率に関係なく開始コロニーの大きさのと分析の両方の対策が同様の結果がでてくるような似ていることを示しています。

図5：図4の正規化されたデータのための手段を示すグラフ。このグラフは明らかにビデオバイオインフォマティクス（CL -クワントソフト）とPhotoshopを使用して、レシピが真実であることを確立行う分析の間に良い一致を示しています。フレーム325のPhotoshopデータの領域のわずかな悪化は、Photoshopの分析に含まれていないいくつかの動画によるものです。

Discussion

ビデオバイオインフォマティクスのツールは、急速にビデオ画像からデータを抽出するために強力です。ヒトES細胞のコロニーの成長を定量化するための我々のプロトコルは、生物学的問題にビデオバイオインフォマティクスのあるアプリケーションを示しています。この方法は定量的であり、個々のヒトES細胞のコロニーからのデータを明らかにする興味深い機能を備えています。ビデオバイオインフォマティクスのレシピは、増殖、遊走、アポトーシス、および基板への細胞接着、および隣接するセルにセルの添付ファイルとして他の細胞プロセスを監視するために開発することができます。 CL -クワントソフトウェアを使用して開発されたレシピの精度は、Photoshopを使用して検証され、真実であることがわかった。適切なレシピが開発されたら、任意のソースからビデオデータは非常に迅速に分析することができます。ビデオバイオインフォマティクスのツールを使用してビデオデータを分析するために必要な時間は、Photoshopを使用して手動で実行する解析のために必要な時間よりも大幅に少なくなります。分析を行う人間が画像を分析されるたびにエラーやわずかに異なる判断を下すかもしれないが、コンピュータが、同じように毎回データを分析するとまた、コンピュータによって行われた分析では、ミスも少なくなります。このプロトコルの一部として議論されていないが、ビデオはまた、コロニーの形態変化を調べることができます。このパラメータは、治療群が含まれている場合に有用であろう。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
mTeSR1 Human Embryonic Stem Cell Maintenance Medium	Stem Cell Technologies	05850	or any suitable medium for hESC culture.
BD Matrigel	BD Biosciences	356234	or other suitable substrate.
DMEM/F12 Basal Medium	Invitrogen	11330-032
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+
Accutase Enzyme Cell Detachment Medium	eBioscience	00-4555-56	or other suitable detachment enzyme.
3mm Glass beads	Fisher Scientific	11-312A	optional.
12-well Tissue Culture Plates	BD Biosciences	353043	or any other plate format.
Nikon BioStation CT/IM			or other incubator/microscope suitable for collecting video data.
CL-Quant software (Nikon) and/or Photoshop (Adobe).