Микроинъекция эмбрионов оризии для использования в качестве модели Генетические организма

Summary

Оризии и данио являются взаимодополняющими для генетических вскрытия позвоночных функции генома. Этот протокол освещаются ключевые моменты для успешного микроинъекции в эмбрионы оризии, важная техника для эмбриологических и генетических анализа с использованием оризии и данио в лаборатории.

Abstract

В этом видео мы продемонстрируем техники микроинъекции в одно-клеточной стадии эмбрионов оризии. Оризии небольшой откладки яиц пресноводных рыб, что позволяет как генетические, так и эмбриологических анализы и является одной из позвоночных организмов модель, в которой генома фенотипа мутанта управляемых экранов проводились ^1, как и данио рерио и мыши. Дивергенция функциональных перекрытия связанных генов между оризии и данио позволяет идентифицировать новые фенотипы, которые идентифицированы в один вид ^2, таким образом оризии и данио являются взаимодополняющими для генетических вскрытия позвоночных функции генома.

Для того чтобы воспользоваться оризии рыбы чьи эмбрионы являются прозрачными и развитие внешне, микроинъекции является важной техникой для введения клеточного индикаторов для маркировки клеток, мРНК или антисмысловые олигонуклеотиды более-выражения и стучать вниз гены интерес, и ДНК для создания трансгенных линий.

Protocol

1. Спаривание и сбор яиц

1. Женский и мужской оризии можно легко отличить по размеру и форме анального и спинного плавников. Анальный плавники самцы крупнее и параллелограмм формы по сравнению с самками. Женщины анальный плавник меньше, и треугольник форму. Мужской спинной плавник имеет четко видны глубокие выемки между двумя последними лучами.
2. Оризии откладывает до 40 яиц каждый день и оризии женщин нести яйца группируются в животе в результате наложения ареста нитей в течение нескольких часов, прежде чем они сняли на заводах в бак.
3. Женщины могут попасть в сеть и проведена внутри аккуратно с обеих сторон, одной рукой. Яйца могут быть затем мягко дразнили из живота с указательным пальцем другой руки. Женщина может быть затем возвращается в бак. Яйца должны быть переданы в 6 см чашку Петри заполнены эмбрион СМИ тупым пинцетом или пальцами.
4. Оризии пары редко бороться, когда они хранятся в небольшом окне спаривания. Таким образом, они могут храниться в одной небольшой бак с водой, чтобы они могли кормить и яйца могут быть собраны из той же паре каждый день в течение нескольких месяцев.
5. Важно, чтобы женщина рыба не должна быть без мужчины, поскольку овуляция происходит каждый день в оризии женщин. В противном случае, женщины не могут доставить яйца и стал себя плохо.

2. Очистка эмбрионов

1. Передача вне кластера яйца с стеклянную пипетку, чтобы наждачную бумагу (P2000 зернистостью, водонепроницаемый), размещенные в крышке 9 см чашке Петри. Удалите излишки среде, но обеспечить достаточный объем остается, как предотвратить высыхание эмбрионов.
2. Аккуратно ролл эмбрионов на наждачную бумагу использовании указательного пальца, применяя минимальное давление и сохраняя палец параллельно поверхности наждачной бумагой около 45-60 секунд, чтобы удалить некоторые внешние волоски поверхности хориона. Не ролл более 5-7 эмбрионов одновременно эта мера предосторожности позволит свести к минимуму риск дробления эмбрионов под друг друга.
3. Передача очищены эмбрионов свежие блюда из эмбриона среды.

3. Создание агарозном пластины для проведения эмбрионов во время микроинъекции

Эмбрионы находятся в желоба во время инъекции сделаны с плексигласа плесени в 1,5% агарозном (рис. 1). Концентрация агарозы важно провести эмбрионов должным образом.

1. Во-первых, сделать рамку из агарозы провести плексигласа плесени. Залить 1,5% агарозы в воде до 0,5 см глубиной в 9 см чашку Петри и ждать, пока оно полностью затвердевает. Вырежьте области агарозном просто больше, чем размер формы.
2. Залить 1,5% агарозном заполнить сократить площадь и место пресс-формы, чтобы не быть пузырьков и ждать, пока агарозном затвердевает. Эта пластинка агарозы можно хранить в холодильнике, чтобы ускорить solidifaction.
3. Удалить плесень создать корыта, чтобы держать яйца. Добавьте достаточно средний эмбриона, чтобы погрузить форму, накрыть крышкой и хранить при 4 ° С до необходимости.
   
   
   Рисунок 1. Схема заказные формы используются для подготовки желоба в виде пластин агарозы для микроинъекции.

4. Микроинъекция эмбрионов оризии

В оризии, ДНК, РНК, олигонуклеотидов и морфолино трассирующими красители microinjected через хориона в цитоплазму с 1 по 64-клеточной стадии эмбриона, а не как в желтке рыбок данио. С цитоплазме меньше и менее заметны в оризии, практики путем введения красителей, таких как родамин-декстран рекомендуется развивать этот навык. Добавление фенол красный, как трассирующие также предлагается возможность подтвердить инъекций.

Как хориона окружающих оризии эмбрионов жесткие, короткие, крепкие и широкие инъекционной иглой не требуется (рис. 2). Подготовка этого сильного широкий иглой с нитью содержащих стеклянный капилляр.

1. Подготовка раствора для инъекций с фенолом красным, как трассирующие и загрузите его в иглу из спины с Эппендорф microloader. Подключите иглой воздушный насос инжектор.
2. Яйца должны быть собраны и вне кластера как можно скорее после оплодотворения вводить в один-клеточной стадии. Более эмбрионы могут быть введены, храня их на льду (не более 30 минут), чтобы остановить деление клеток.
   
   
   Рисунок 2. Сравнение оризии и данио иглы. Обратите внимание на кончике иглы MF (вверху) короче и шире, следовательно, сильнее для прокалывания жесткие хориона окружающих оризии эмбрионов.
3. Передача яйца в пластину агарозы и приведения их в желоба щипцами. Незадолго до инъекции, пять яиц должна быть повернута так, клеточной мембране одной цитоплазме клеток может попасть йэлектронной иглу перпендикулярно. Цитоплазмы одной клетки может быть найден путем поиска области лишенной маленькие капельки масла, которое противоположно стороне яйца с плотной капель масла. Определены области может быть подтверждено, что цитоплазма при просмотре со стороны.
4. Место рядом с иглу яйца. Открытое кончике иглы, осторожно касаясь кончиком иглы хориона или с использованием microforceps (рис. 3). Небольшое количество инъекций вещества следует рассматривать вытекать.
5. Прокол через хориона поместить кончик иглы внутри хориона. Отрегулируйте проведения давление инжектора являются относительно высокими, чтобы убедиться в отсутствии рефлюкс возникает из-за высокого давления на прокол через жесткую хориона (настройки 80-100hPA для проведения давление и 500-700hPA для инъекций давления).
6. Вставьте кончик иглы в цитоплазме резким тыкая ее мембрану.
   
   Избегайте вставки кончике иглы в желтке. В отличие от данио рерио, материала вводят в желток не будет передана в цитоплазму. Введенный жидкости имеют четкой границы при введении в желтке в то время как граница размыта, когда в цитоплазме (рис. 4).
   
   Иногда игла может стать заблокирован агарозы / мусора. Пинцет может быть использован для сенсорного / повторно разбивать конце иглы и снять блокаду. Если игла перерывы в любой момент во время инъекции, пузырьков будет видно в эмбрион среднего и вещества вы инъекционных будут потеряны. Инъекции должны проводиться систематически сверху вниз по каналам агарозы и слева направо, по всей форме.
7. Введенный эмбрионы должны быть переданы в чистой блюдо с эмбрионом средних и разработаны при соответствующей температуре.
   
   
   Рисунок 3. Нарушение иглы перед инъекцией. 1: Перемещение кончик иглы близко к хориона эмбриона; 2: сенсорный хориона и перемещать иглу взад и вперед, мягко сломать кончик, 3: Когда небольшое количество инъекции вещество вытекает из конца иглы этой поломки подтверждает острия.

5. Представитель результаты

Рисунок 4. Представителю изображения вводят эмбрионы оризии. Группа показывает, представитель образ правильной инъекции родамина-декстран в цитоплазме одноклеточного стадии эмбриона оризии. Группа B показывает, представитель образ неправильного введения родамин-декстран в желточный мешок из одноклеточных стадии эмбриона оризии. Панели C и D показывают эмбрионов из панелей А и В соответственно, примерно в 30 часов после инъекции. Е. М.: эмбрион, является передней панели вверх в С и D и зрения спинной. Обратите внимание, тело эмбриона в панели D не красный, как краситель был неправильно введен в желточного мешка. Стрелки B и D указывают родамин-декстран вводится неправильно в желточный мешок отметить отличие круговой границей. Пунктирные линии в А и В указывают контуры цитоплазмы одной клетки, представление боковых.

Discussion

В этом видео мы продемонстрируем метод для сотовых трассирующими, мРНК, ДНК или антисмысловой олигонуклеотид инъекции в одно-клеточной стадии эмбрионов оризии. Эта техника позволила нам изучать различные процессы развития в естественных условиях в режиме реального времени. Этот процесс и последующего детального анализа он предоставляет имеет потенциал, чтобы значительно расширить наше понимание позвоночных органогенеза и лежащий в основе клеточной биологии. Такие знания могут иметь важное значение для, и урожайность терапевтического применения в регенеративной медицине.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
4" fine net	Tools	J K Aquatics Ltd.	MD001	Used to capture fish during egg harvesting.
Embryo medium	Reagent	Home made		200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.
Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size	Tools	Hermes Abrasives Ltd.		Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.
Borosilicate glass capillaries	Tool	Harvard Apparatus	GC100-10F	For making microinjection needles.
Micropipette puller	Equipment	Narishige International	Model PP-830	For making microinjection needles.
Eppendorf microloader	Tool	Eppendorf	5242956.003	For loading microinjection needles.
Microinjector apparatus	Equipment	Eppendorf		Model 5242.
Micromanipulator	Equipment	Narishige International		Model MN151.
Agarose injection plate	Tools	Home made		For holding embryos during injection.