作为一个型号的遗传生物鳉胚胎显微注射

Summary

鳉和斑马鱼是脊椎动物的基因组功能基因夹层互补。该协议凸显成功鳉胚胎微量注射，在实验室中使用的青鳉和斑马鱼的胚胎和遗传分析的重要技术关键点。

Abstract

在这段视频中，我们展示了一细胞阶段鳉胚胎显微注射技术。青鳉是一个小产蛋的淡水鱼类，允许遗传和胚胎学分析，是脊椎动物的模式生物体的表型驱动的全基因组突变的屏幕^进行了1在斑马鱼和小鼠，之一。鳉和斑马鱼之间的相关基因的功能重叠的分歧使得新颖，品种单一，从而鳉和斑马鱼是脊椎动物的基因组功能基因清扫互补难以辨认的表型鉴定。

为了充分利用鳉鱼的胚胎是透明的，发展的外部，显微注射法是一个重要的技术注入基因过度表达，敲下来的利益和国家主管部门作出标签的细胞，mRNA的反义寡核苷酸细胞示踪转基因株系。

Protocol

1。交配和收集鸡蛋

1. 女性和男性鳉可以很容易地分辨臀鳍和背鳍的大小和形状。的女性相比，男性的臀鳍较大，平行四边形形。女性臀鳍较小，三角型。男性的背鳍之间的最后两条射线清晰可见深的缺口。
2. 鳉奠定了每天40鸡蛋和青鳉女性进行聚集在他们肚子里几个小时的附件细丝的鸡蛋才剥离在水箱中的植物。
3. 女性可以捕净和举行内部两侧轻轻一方面。鸡蛋然后可以从另一方面食指腹轻轻地戏弄。女性可以再返回油箱。鸡蛋应转移到与胚胎媒体充满钝钳或手指一个6厘米的培养皿。
4. 鳉对很少打时，他们都保持在一个小交配框。因此，他们可以在一个小坦克与水流，使他们可以喂养和鸡蛋可以收集几个月每天从同一对。
5. 重要的是母鱼不应该保持无男性，因为排卵发生在鳉女性的日常。否则，女性不能提供鸡蛋，成为不适。

2。清洁胚胎

1. 转让非集群鸡蛋一个玻璃吸管放置在一个9厘米培养皿的盖子，以砂纸（P2000粒度，防水）。删除多余的介质，但保证足够的量仍然以防止干燥胚胎。
2. 砂纸使用的食指轻轻地滚上的胚胎，用最小的压力，并保持了大约45-60秒手指砂纸表面平行，以消除一些绒毛膜外表面毛。滚不要超过一次5-7胚胎此预防措施，将最大限度地减少风险破碎下对方的胚胎。
3. 清洗的胚胎转移到胚胎培养基的新鲜菜。

3。期间举行显微注射​​胚胎琼脂糖板

在与模具（图1）在1.5％琼脂糖有机玻璃制成的注射，胚胎被关押在低谷。琼脂糖的浓度是很重要的妥善举行胚胎。

1. 首先，琼脂糖帧举行的有机玻璃模具。 1.5％琼脂糖倒入水在一个9厘米培养皿0.5厘米深度和等待，直到它完全凝固。切出模具的大小仅比大面积琼脂糖。
2. 倒入1.5％的琼脂糖填补截面积和地点，无气泡，使被困模具，等到琼脂糖凝固。这琼脂糖板可存放在冰箱加快solidifaction。
3. 取出模具创建槽举行的鸡蛋。补充足够的胚胎中期沉浸在4℃直至所需的模具，封面和存储。
   
   
   图1。定做模具用来准备在显微注射琼脂糖板槽的示意图。

4。青鳉胚胎微量注射

在青鳉DNA，RNA，吗啉代寡核苷酸和示踪染料是显微注射绒毛膜进入细胞质中的1到64细胞阶段的胚胎，而不是在斑马鱼的卵黄。由于细胞质在青鳉更小，更可见，注射染料如罗丹明-葡聚糖是建议制定这个技能的做法。酚红作为示踪此外还鼓励，允许注射的确认。

由于周围的青鳉胚胎绒毛膜是艰难的，一个短，结实，宽的注射针（图2）。准备从灯丝含玻璃毛细管这种强烈的广泛的注射针头。

1. 准备注射液与酚红作为示踪剂，并与Eppendorf公司microloader背面装载进针。空气泵喷油器的针连接。
2. 鸡蛋必须尽快收集和非集群受精后注入单细胞阶段。可以注入更多的胚胎，它们储存在冰（不超过30分钟），阻止细胞分裂。
   
   
   图2。鳉和斑马鱼针的比较。注意的MF针尖（顶）更短和更广泛的，因此鳉胚胎周围的强硬绒毛膜穿刺。
3. 琼脂糖板转移到鸡蛋和调整钳波谷。注射前，5个鸡蛋，应该是这样的一个细胞的细胞质的细胞膜可以打日的旋转Ë针直刺。一个细胞的细胞质中可以发现，寻找一个没有面积小的油滴，这是对面一侧的鸡蛋最密集的油滴。从侧面观看，所确定的区域可以被证实为细胞质。
4. 将针头靠近鸡蛋。打开针尖轻轻触摸针尖绒毛膜或使用microforceps（图3）。应该看到少量的注射物质流出来了。
5. 通过绒毛膜穿刺放置绒毛膜针内的一角。调整喷油器的控股是比较高的，以确保没有回流的发生是由于穿刺后高的压力，通过艰难的绒毛膜（80 100hPA设置保压压力和注射压力500 - 700hPA）的压力。
6. 通过大幅戳其膜，进入细胞质中插入的针尖。
   
   避免针尖插入蛋黄。不同的斑马鱼，注入蛋黄的材料将不被转移到细胞质中。注入的液体有明显的边界时注入蛋黄，而边界是模糊的，当在细胞质中（图4）。
   
   偶尔针可能成为阻止琼脂糖/碎片。镊子可用于触摸/ rebreak针年底，清除堵塞。如果针在注射过程中的任何一点断裂，鼓泡将被视为胚胎培养基中，你是注射的物质都将丢失。注射剂应进行系统从底部沿琼脂糖渠道，由左向右横跨模具。
7. 注射的胚胎被转移到一个干净的菜，含有胚胎培养基，并在适当的温度开发。
   
   
   图3。断裂的针头注射前。 1：移动提示针接近胚胎绒毛膜; 2：触摸绒毛膜和向前和向后移动针轻轻打破头; 3：当少量的物质注射针年底流动确认破损小费。

5。代表性的成果

图4。注入青鳉胚胎的代表图像。小组A显示了一个正确罗丹明-葡聚糖注射到一个细胞阶段鳉胚胎的细胞质的形象代表。小组B显示了一个不正确的注入一细胞阶段的青鳉胚胎的卵黄囊罗丹明-葡聚糖的形象代表。面板C和D显示面板的胚胎，A和B，分别在注射后约30小时。 EM：胚胎，前面板中向上的C和D，并查看背。请注意面板ð胚胎身正，不红染料被错误地注入到卵黄囊。在B和D的箭头指示罗丹明-葡聚糖注入卵黄囊不正确，请注意不同的圆形边界。点分线A和B表明，单细胞的细胞质的轮廓，视图是横向的。

Discussion

在这段视频中，我们展示了一细胞阶段鳉胚胎细胞示踪，基因，DNA或反义寡核苷酸注射的方法。这项技术已经允许我们研究各种发育过程实时在体内 。这个过程和随后的详细分析，它可以提供有可能显着提高我们的脊椎动物器官和细胞生物学的基本认识。这种知​​识可能是重要的，产量在再生医学治疗应用。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
4" fine net	Tools	J K Aquatics Ltd.	MD001	Used to capture fish during egg harvesting.
Embryo medium	Reagent	Home made		200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.
Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size	Tools	Hermes Abrasives Ltd.		Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.
Borosilicate glass capillaries	Tool	Harvard Apparatus	GC100-10F	For making microinjection needles.
Micropipette puller	Equipment	Narishige International	Model PP-830	For making microinjection needles.
Eppendorf microloader	Tool	Eppendorf	5242956.003	For loading microinjection needles.
Microinjector apparatus	Equipment	Eppendorf		Model 5242.
Micromanipulator	Equipment	Narishige International		Model MN151.
Agarose injection plate	Tools	Home made		For holding embryos during injection.