Summary
El presente método permite criostato reproducible la sección de los pequeños trozos de tejido, difícil de manejar, tales como las biopsias y las rodajas de cerebro. Utilizamos una etapa de aluminio de congelación sencillo para facilitar la manipulación de los tejidos y un criostato de rutina estándar para producir secciones 5-10 micrones de serie a partir de 400 rebanadas de cerebro micras de espesor.
Abstract
Muchas investigaciones de la neurociencia, así como otras disciplinas, implican el estudio pequeño, pero las piezas macroscópicas o secciones de tejido que se han conservado, recién retirado, o eliminado, pero mantuvo viable, como en los preparativos trozo de tejido cerebral. Posteriores estudios microscópicos de este material puede ser un reto, ya que las muestras de tejido puede ser difícil de manejar. Demostrado aquí es un método para la obtención de secciones delgadas criostato de tejido con un espesor que puede variar 0,2-5,0 mm. En forma rutinaria cortar 400 micrones de espesor rebanadas de cerebro Vibratome serie en secciones 10/05 micras criostato coronal. Los cortes son generalmente utilizado por primera vez para los experimentos de electrofisiología y requieren de un análisis microscópico de la citoarquitectura de la región de la que las grabaciones fueron observados. Hemos construido un sencillo dispositivo que permite la preparación controlada y reproducible y la colocación de la lámina de tejido. Este dispositivo consiste en un cilindro de 5 cm de longitud con un diámetro de 1,2 cm, que sirve como una etapa de congelación de la división. Un anillo perfectamente se desliza sobre las paredes del cilindro proporcionando alrededor de la porción permite que el tejido se sumerge en el complejo de congelación (por ejemplo, octubre). Esto es luego rápidamente congelados con hielo seco triturado y la oblea resultante puede ser fácilmente la posición de seccionamiento criostato. Secciones delgadas se pueden descongelar montados en portaobjetos recubiertos para permitir estudios a realizar, tales como diversos métodos de tinción, hibridación in situ, o inmunohistoquímica, como se muestra aquí.
Protocol
- Prepare el molde de la cinta para la plataforma de octubre
- Colocar el molde con octubre Congelar en criostato o mediante el uso de hielo seco triturado.
- Retire la cinta de todo congelado plataforma de octubre
- Alinear las marcas de tenazas de congelación y la etapa de montaje criostato y el bloqueo en el mandril.
- Sección a través de la plataforma octubre hasta que la superficie es plana.
- Quitar resurgió plataforma octubre y el lugar en el escenario de congelación criostato.
- Colocar la muestra de tejido (previamente criopreservados con 30% de glicerol o sacarosa en PBS) en octubre
- Preparar la columna de congelación con anillo exterior sobresale alrededor de 5 mm por encima de la parte superior de la columna formando bien para octubre
- Cuidadosamente la posición de muestra de tejido en el centro de la superficie de la columna de congelación y agregue lentamente octubre hasta el pozo se llena.
- Rodean la columna de congelación con hielo seco triturado. Tejido y octubre debería congelar completamente dentro de 20-60 segundos.
- A medida que aumenta la preparación de la temperatura, el anillo exterior se puede quitar, mientras que la muestra permanece congelado.
- Diapositivas de muestra de la columna hacia un lado la congelación y el lugar en el criostato.
- Coloque una gota de octubre en la superficie de la plataforma de octubre y muestra la posición (el tejido hacia abajo) aplicando una presión firme. Espécimen se congela rápidamente en la plataforma octubre
- Seguro manguito a criostato montaje escenario con alineación de las marcas.
- Sección a través de octubre superficial de la muestra de tejido.
- Descongele montaje de secciones delgadas en portaobjetos de vidrio y guardar congelados oa temperatura ambiente.
- Inmunoreacciones se puede realizar para el tejido montados en portaobjetos de vidrio.
- Reactivo se reunieron en la diapositiva, se puede agitar suavemente, y puede ser cubierto en caso de sensible a la luz.
- Las etapas posteriores de la reacción se realiza fácilmente por diapositivas invirtiendo en el receptáculo de residuos, que absorbe la diapositiva, y luego aplicar el siguiente reactivo.
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Discussion
El protocolo que aquí se presenta ofrece a los investigadores con un conciso y fácil de seguir, resumen de cómo obtener secciones delgadas criostato de pequeños trozos de tejido, difícil de manejar, tales como las biopsias y las rodajas de cerebro de más estudios para llevar a cabo, tales como diversos métodos de tinción, hibridación in situ, o inmunohistoquímica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O. C. T. | Ted Pella, Inc. | 27050 | |
| Glycerol Solution | 30% Glycerol Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | 30% Sucrose Solution in PBS w/v |
References
- Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M.
- Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).
