Summary
השיטה הנוכחית מאפשרת cryostat לשחזור של חתך, קשה לניהול, חתיכות קטנות רקמות, כגון ביופסיה, פרוסות המוח. אנו מנצלים אלומיניום פשוט מקפיא הבמה כדי להקל על הטיפול רקמות cryostat רגיל שגרתי לייצר חלקים 5-10 מיקרון סדרתי של פרוסות 400 מיקרון עבה המוח.
Abstract
חקירות רבות במדעי המוח, כמו גם מתחומים אחרים, לערב לימוד קטנות, אך חלקים מאקרוסקופיים או חלקים של רקמת שנשתמרו, הסיר טרי, או נכרת, אבל המשיכה קיימא, כמו פרוסת ההכנות של רקמת המוח. מחקרים מאוחרים יותר מיקרוסקופיים של חומר זה יכול להיות מאתגר, כמו דגימות רקמה עלול להיות קשה להתמודד. הפגינו כאן היא שיטה לקבלת סעיפים cryostat דקה של רקמה בעובי זה עשוי לנוע בין 0.2-5.0 מ"מ. אנו שגרתי לחתוך עבה 400 מיקרון Vibratome פרוסות המוח סדרתי לתוך סעיפים 5-10 מיקרון העטרה cryostat. פרוסות הם בדרך כלל בשימוש הראשון של הניסויים electrophysiology ואז דורשים ניתוח מיקרוסקופי של cytoarchitecture של האזור שממנו הקלטות נצפו. אנחנו צריכים לבנות מכשיר פשוט המאפשר הכנה מבוקרת לשחזור והמיקום של הפרוסה רקמות. מכשיר זה מורכב 5 ס"מ אורך גליל בקוטר של 1.2 ס"מ, המשמש כבמה הקפאת עבור הפרוסה. טבעת הדוקה שקופיות על קירות מתן גליל סביב פרוסה המאפשר את הרקמה להיות שקוע בתוך מתחם הקפאה (למשל, אוקטובר). זהו אז קפוא במהירות עם קרח יבש כתוש רקיק וכתוצאה מכך יכול להיות בעמדה בקלות חתך cryostat. סעיפים Thin ניתן להפשיר רכוב על גבי שקופיות מצופה לאפשר מחקרים נוספים שיש לבצע, כגון שיטות צביעה שונים, הכלאה באתרו, או אימונוהיסטוכימיה, כפי שהודגם כאן.
Protocol
- הכן עובש מהקלטת עבור פלטפורמת אוקטובר
- מלא עובש עם אוקטובר להקפיא בתוך cryostat או באמצעות קרח יבש כתוש.
- הסר את הסרט מרחבי פלטפורמה אוקטובר קפוא.
- יישר סימנים על צ'אק מקפיא בשלב cryostat גובר לנעול צ'אק.
- סעיף באמצעות פלטפורמת אוקטובר עד משטח שטוח.
- הסר resurfaced פלטפורמה אוקטובר מקום על הבמה הקפאת cryostat.
- דגימת רקמה פלייס (cryopreserved בעבר עם גליצרול 30% או סוכרוז ב PBS) ב אוקטובר
- הכן את העמודה הקפאה עם הטבעת החיצונית מקרין על 5 מ"מ מעל גבי טור להרכיב גם עבור אוקטובר
- בזהירות עמדה דגימת רקמה על פני השטח של מרכז עמודה מקפיא לאט להוסיף עד אוקטובר היטב מלא.
- הקף טור מקפיא עם קרח יבש כתוש. רקמות אוקטובר צריך להקפיא לחלוטין בתוך 20-60 שניות.
- עם העלייה בטמפרטורה הכנה, הטבעת החיצונית ניתן להסיר תוך המדגם נשאר קפוא.
- שקופיות מדגם הצידה טור מקפיא מקום cryostat.
- מניחים ירידה של אוקטובר על פני השטח של פלטפורמת אוקטובר ואת הדגימה עמדה (רקמה למטה) הפעלת לחץ תקיף. הדגימה במהרה להקפיא על גבי פלטפורמת אוקטובר
- צ'אק מאובטחת על cryostat הרכבה הבמה עם סימני מיושר.
- סעיף דרך אוקטובר שטחית כדי הדגימה רקמות.
- הפשירי הר חלקים דקים על גבי שקופיות זכוכית ולאחסן קפוא או בטמפרטורת החדר.
- Immunoreactions יכול להתבצע עבור רקמה רכוב על שקופיות הזכוכית.
- הוא מגיב ונקווה לשקופית, יכול להיות נסער בעדינות, עשויים להיות מכוסים אם רגישים לאור.
- בשלבים מאוחרים יותר של התגובה מבוצעים בקלות לתוך כלי קיבול אשפה על ידי היפוך שקופיות, הפתילה את השקופית, ולאחר מכן להחיל את מגיב הבאה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המובא כאן מספק החוקרים עם תמציתי, קל לעקוב אחר קווי המתאר של כיצד להשיג חלקים cryostat דקה, קשה לניהול, חתיכות קטנות רקמות, כגון ביופסיה, פרוסות המוח למחקרים נוספים להתבצע, כגון מכתים שיטות שונות, הכלאה באתרו, או אימונוהיסטוכימיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O. C. T. | Ted Pella, Inc. | 27050 | |
| Glycerol Solution | 30% Glycerol Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | 30% Sucrose Solution in PBS w/v |
References
- Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M.
- Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).
