Summary
Il metodo attuale consente criostato riproducibile sezionamento di piccole dimensioni, difficili da gestire, pezzi di tessuto, come ad esempio biopsie e fette di cervello. Utilizziamo una semplice fase di congelamento in alluminio da facilitare la manipolazione di tessuti e un criostato standard per produrre regolarmente sezioni 5-10 micron di serie da 400 sezioni di cervello micron di spessore.
Abstract
Molte indagini nel campo delle neuroscienze, così come altre discipline, coinvolgono lo studio piccolo, ma pezzi macroscopici o sezioni di tessuto che sono stati conservati, appena rimossa, o espunto ma mantenuto vitale, come in preparazioni fetta del tessuto cerebrale. Successivi studi microscopici di questo materiale può essere impegnativo, come i campioni di tessuto può essere difficile da gestire. Dimostrato qui è un metodo per ottenere sezioni congelate di tessuto sottile con uno spessore che può variare 0,2-5,0 mm. Siamo regolarmente tagliato 400 micron di spessore fette di cervello Vibratome serialmente in 5-10 sezioni congelate micron coronale. Le fette sono tipicamente utilizzato per un primo esperimento di elettrofisiologia e quindi richiedere l'analisi microscopica dei citoarchitettura della regione da cui sono state osservate le registrazioni. Abbiamo costruito un semplice dispositivo che permette la preparazione controllato e riproducibile e il posizionamento della fetta del tessuto. Questo dispositivo è costituito da un cilindro di 5 cm di lunghezza con un diametro di 1,2 cm, che funge da palcoscenico congelamento della porzione. Un anello scivola perfettamente sulle pareti del cilindro che fornisce in tutto il fetta permettendo al tessuto di essere immersi in mescola congelamento (ad esempio, OCT). Questa è poi rapidamente congelato con ghiaccio tritato secco e il wafer risultante può essere posizione facilmente per sezionamento criostato. Sezioni sottili possono essere disgelo-montate su vetrini rivestiti per permettere ulteriori studi per essere eseguito, come vari metodi di colorazione, di ibridazione in situ, o immunoistochimica, come illustrato di seguito.
Protocol
- Preparare stampo da nastro per la piattaforma ottobre
- Riempire stampo con ottobre Blocco entro criostato o utilizzando schiacciato ghiaccio secco.
- Rimuovere il nastro di tutto congelato piattaforma ottobre
- Allineare segni sul mandrino congelamento e criostato fase di montaggio e serratura a mandrino.
- Sezione attraverso la piattaforma di ottobre fino a superficie piana.
- Rimuovere riemersi piattaforma ottobre e il luogo sul palco congelamento criostato.
- Luogo campione di tessuto (precedentemente crioconservati con il 30% glicerolo o saccarosio in PBS) a ottobre
- Preparare colonna congelamento con anello esterno proiettando circa 5 mm sopra la parte superiore della colonna formando bene per ottobre
- Posizionare accuratamente campione di tessuto nella parte centrale della superficie colonna congelamento e aggiungere lentamente fino a ottobre e si riempie.
- Surround colonna congelamento schiacciato con ghiaccio secco. Tessuti e ottobre dovrebbero completamente blocco entro 20-60 secondi.
- Con l'aumentare della preparazione della temperatura, l'anello esterno può essere rimosso mentre il campione rimane congelato.
- Diapositiva campione fuori lateralmente colonna congelamento e il luogo in criostato.
- Goccia luogo di ottobre sulla superficie della piattaforma di ottobre e il campione di posizione (il tessuto verso il basso) applicando una pressione decisa. Campione rapidamente congelare sulla piattaforma ottobre
- Mandrino sicuro sul criostato di montaggio palco con segni allineati.
- Sezione di ottobre superficiale al campione di tessuto.
- Scongelare il montaggio su sezioni sottili lastre di vetro e conservare congelati oa temperatura ambiente.
- Immunoreazioni può essere eseguita per tessuto montate su lastre di vetro.
- Il reagente è in pool sul vetrino, possono essere leggermente agitato, e possono essere coperti se sensibile alla luce.
- Le successive fasi della reazione sono facilmente eseguiti da scivolare invertendo nella presa dei rifiuti, che l'assorbimento della diapositiva e quindi applicando il reagente successivo.
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Discussion
Il protocollo qui presentato fornisce ai ricercatori un conciso, facile da seguire di ingombro di come ottenere criostato sezioni sottili di piccole dimensioni, difficili da gestire, pezzi di tessuto, come ad esempio biopsie e fette di cervello per ulteriori studi da eseguire, come ad esempio vari metodi di colorazione, di ibridazione in situ, o immunoistochimica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O. C. T. | Ted Pella, Inc. | 27050 | |
| Glycerol Solution | 30% Glycerol Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | 30% Sucrose Solution in PBS w/v |
References
- Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M.
- Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).
