Summary
Navelsträngen används för att isolera glatta muskelceller av olika sätt. I detta arbete använde vi enzymatisk behandling till isolerade glatta muskelceller.
Abstract
Den mänskliga navelsträng (UC) är ett biologiskt prov som enkelt kan erhållas strax efter födseln. Denna biologiska prov, för det mesta, kasseras och insamlingen inte innebär någon extra risk för det nyfödda barnet eller modern hälsa. Dessutom inga etiska frågor väcks. UC är komponerad av en ven och två artärer som både endotelcellerna (ECS)
Protocol
- Artärer erhålls från UC bitar 3-7 cm.
- Wharton gelé som omger blodkärlen var försiktigt bort genom att klippa den med sax.
- Ett trubbigt slut nål i en yttre diameter på 0,6-1mm sattes in ca 7 mm från ena änden av dissekeras artärerna.
- För att ta bort blod kvar inuti fartyg, är artärerna vertikalt hålls och perfusion med cirka 20 till 40 ml, fysiologisk koksaltlösning (PSS), med hjälp av en 20-mL spruta kopplad till en nål. Om det behövs, var detta tvättsteg upprepas flera gånger.
- Samma procedur upprepades med RPMI 1640 kompletteras med 10% fetalt bovinserum (FBS).
- Ena änden av blodkärl var stängd. En 10-ml spruta var ansluten till nålen och perfusion med 3 ml kollagenas typ I (800 enheter / ml Hanks buffrad saltlösning (HBSS)). Sedan den andra extremityof fartyget var också stängd.
- Fartyget var inkuberas med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), i 15 minuter vid 37 ° C med agitation.
- Efter ändarna av fartyget kapades för att samla in de fria SMC. Artärerna var BEGJUTA med cirka 20 till 40 mL DMEM-F12 kompletterad med 5% av FBS och antibiotika till en 50-mL rör.
- Röret centrifugerades vid rumstemperatur (250 g, 8 min) och cellpelleten var suspenderade i 5 ml DMEM-F12 kompletterad med 5% av FBS.
- Cellsuspensionen överfördes till en kollagen-belagd T-kolv och inkuberas vid 37 ° C, under en 5% CO 2 fuktad atmosfär.
- Efter 5 16 h, den icke-häftande celler och drebis togs bort, var 5 ml odlingsmedium läggas och cellerna inkuberades vid 37 ° C, under en 5% CO 2 fuktad atmosfär.
- I cellodling media ändrades var 2 3 dagar tills SMC nådde sammanflödet.
- Efter att cellerna uppnått sammanflödet de var seedade i två eller tre 25 cm 2 T-kolvar.
Cleanup
- Kasta nålar i avfallsbehållare.
- Kasta sprutor i stora biologiskt behållare.
- Lägg alla vävnader i en liten biologiskt väska. Stäng påsen och frys vid -20 ° C till förbränning.
- Blötlägg alla instrument i virucide i minst 10 min.
- Tillbaka oanvända media till kylskåp.
- Kasta handskar i biologiskt avfall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SMC kan användas som modeller för framtida analyser med constrictor droger, att isolera och strukturellt präglar L-typ kalciumkanaler, för att studera cellulära och molekylära aspekter av vaskulär funktion och använda dem i vävnadsteknik. SMC och ECS är grundläggande för utvecklingen av nya biomaterial som kan användas i produktionen av semi syntetiskt blodkärl för att användas på människa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Sjukhus Amato Lusitano, Castelo Branco Portugal.
Sjukhus Sousa Martins, Guarda Portugal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | 095K8311 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biochrom AG | 0117T | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 3103806 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | 067K2302 | |
| Antibiotic | 10 μL/ 1 mL of medium | ||
| Scissors | Sterilized | ||
| Needle | Diameter of 0.6-1mm | ||
| Syringe | 10 - 20 mL | ||
| Physiological Saline Solution (PSS) | 20-40 mL per artery | ||
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | 047K1052 | 3 mL per artery |
| Hank’s Buffered Salt Solution(HBSS) | Diluted collagenase | ||
| Phosphate buffered saline solution (PBS) | Warmed to 37°C |
References
- Van Rijen, H. Gap junctions in human umbilical cord endothelial cells contain multiple connexins. The American journal of physiology. 272 (1 PT 1), C117-C117 (1997).
- Martín de Llano, J. Procedure to consistently obtain endothelial and smooth muscle cell cultures from umbilical cord vessels. Translational Research. 149 (1), 1-9 (2007).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Cairrão, E., Santos-Silva, A., Alvarez, E., Correia, I., Verde, I. Isolation and culture of human umbilical artery smooth muscle cells expressing functional calcium channels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 45 (3), 175-184 (2009).
