Summary
Le cordon ombilical sont utilisées pour isoler des cellules musculaires lisses de différentes façons. Dans ce travail nous avons utilisé le traitement enzymatique de cellules musculaires lisses isolées.
Abstract
Le cordon ombilical humain (UC) est un échantillon biologique qui peut être facilement obtenue juste après la naissance. Cet échantillon biologique est, la plupart du temps, mis au rebut et leur collection ne signifie pas que tout risque ajoutée à la santé maternelle et néonatale ou la mère s. En outre, aucune des préoccupations éthiques sont soulevées. L'UC est composé d'une veine et deux artères à partir de laquelle les deux cellules endothéliales (CE)
Protocol
- Les artères sont obtenus à partir de morceaux de 3-7 cm de l'UC.
- Gelée de Wharton qui entoure les artères a été soigneusement enlevé en le coupant avec des ciseaux.
- Une aiguille à bout émoussé d'un diamètre extérieur de 0,6-1mm a été inséré environ 7mm d'une extrémité de l'artère disséquée.
- Pour retirer le sang restant à l'intérieur des vaisseaux, les artères sont tenu verticalement et perfusés avec environ 20 à 40 ml, solution saline physiologique (PSS), en utilisant une seringue de 20 ml connecté à une aiguille. Si nécessaire, cette étape de lavage a été répété à plusieurs reprises.
- La même procédure a été répétée en utilisant du RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS).
- Une extrémité d'un vaisseau sanguin a été fermé. Une seringue de 10 ml a été relié à l'aiguille et perfusé avec 3 ml de collagénase de type I (800 unités / ml en solution saline tamponnée de Hank (HBSS)). Puis l'autre extremityof le navire a également été fermée.
- Le navire a été incubée avec une solution saline tamponnée de phosphate (PBS), pendant 15 min à 37 ° C avec agitation.
- Après les extrémités du navire ont été coupés pour recueillir les SMC libre. Les artères ont été perfuser avec environ 20 à 40 mL de DMEM-F12 supplémenté avec 5% de FBS et des antibiotiques à un tube de 50 ml.
- Le tube a été centrifugé à température ambiante (250 g, 8 min), et le culot cellulaire a été resuspendu dans 5 ml de DMEM-F12 supplémenté avec 5% de FBS.
- La suspension cellulaire a été transféré à un revêtus de collagène de T-ballon et incubées à 37 ° C, sous une atmosphère de CO 2 5% humidifié.
- Après 5 h 16, les cellules non-adhérentes et drebis cellulaires ont été enlevés, 5 ml de milieu de culture a été ajouté et les cellules ont été incubées à 37 ° C, sous une atmosphère de CO 2 5% humidifié.
- Les milieux de culture cellulaire a été changé tous les 2 trois jours, jusqu'à ce que SMC a atteint la confluence.
- Après cellules atteint la confluence, ils ont été ensemencés dans deux ou trois de 25 cm 2 flacons T.
Nettoyage
- Jeter les aiguilles dans le collecteur de déchets.
- Disposez des seringues dans les containers prévus à grande.
- Mettez tous les tissus dans un petit sac biohazard. Fermer le sac et congeler à -20 ° Celsius jusqu'à l'incinération.
- Faire tremper les instruments dans virucide pour au moins 10 min.
- Retour supports inutilisés au réfrigérateur.
- Jeter les gants dans les déchets biologiques dangereux.
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Discussion
Le SMC peut être utilisé en tant que modèles pour les essais futurs avec des médicaments constrictor, d'isoler et de caractériser les canaux calciques structurellement de type L, d'étudier les aspects cellulaires et moléculaires de la fonction vasculaire et de les utiliser dans l'ingénierie tissulaire. SMC et ECS sont fondamentales pour le développement de nouveaux biomatériaux qui peuvent être utilisés dans la production de semi-synthèse des vaisseaux sanguins pour être utilisé chez l'homme.
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Acknowledgments
Hôpital Amato Lusitano, Castelo Branco au Portugal.
Hôpital Sousa Martins, Guarda au Portugal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | 095K8311 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biochrom AG | 0117T | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 3103806 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | 067K2302 | |
| Antibiotic | 10 μL/ 1 mL of medium | ||
| Scissors | Sterilized | ||
| Needle | Diameter of 0.6-1mm | ||
| Syringe | 10 - 20 mL | ||
| Physiological Saline Solution (PSS) | 20-40 mL per artery | ||
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | 047K1052 | 3 mL per artery |
| Hank’s Buffered Salt Solution(HBSS) | Diluted collagenase | ||
| Phosphate buffered saline solution (PBS) | Warmed to 37°C |
References
- Van Rijen, H. Gap junctions in human umbilical cord endothelial cells contain multiple connexins. The American journal of physiology. 272 (1 PT 1), C117-C117 (1997).
- Martín de Llano, J. Procedure to consistently obtain endothelial and smooth muscle cell cultures from umbilical cord vessels. Translational Research. 149 (1), 1-9 (2007).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Cairrão, E., Santos-Silva, A., Alvarez, E., Correia, I., Verde, I. Isolation and culture of human umbilical artery smooth muscle cells expressing functional calcium channels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 45 (3), 175-184 (2009).
