Analyse immunocytochimique des cellules souches pluripotentes humaines en utilisant un appareil Self-Made Cytospin

Summary

Suspension coloration immunocytochimique de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) pour les marqueurs de surface cellulaire (SSEA-3/SSEA-4) a été réalisé basée sur l'utilisation d'un appareil de self-made cytospin de créer une monocouche de cellules d'observation et de quantification.

Abstract

Cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) qui incluent des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et humains cellules souches pluripotentes induites (hiPSCs) sont des sources de cellules passionnante en raison de leur auto-renouvellement illimité des capacités et leur potentiel de se différencier en plusieurs types cellulaires. L'état pluripotent des hPSCs est généralement évaluée par des techniques telles que qPCR, immunocytochimie, et par d'autres

Protocol

Partie 1: Coloration Suspension immunocytochimique

1. Les cellules sont récoltées dans une suspension cellulaire unique.
2. Les cellules sont ensuite transférés dans des microtubes de 1,5 2mL et centrifugé à 200g pendant 4 minutes.
3. Les cellules sont lavées par l'aspiration à surnageant, remis en suspension dans 1ml de PBS - (sans Mg ^{2 +} et Ca ^{2 +)} et ensuite centrifugé à nouveau à 200g pendant 4 minutes. Cela devrait être fait deux fois.
4. Après lavage, les cellules sont alors fixées par remise en suspension eux dans 1 ml de paraformaldéhyde 4% (PFA) à température ambiante pendant 10 minutes.
5. Les cellules sont lavées à nouveau deux fois avec 1 mL de PBS -.
6. Après le lavage des cellules bloc, en re-suspension eux dans 1 ml de solution Block (6% serum/94% PBS -). Incuber ces à température ambiante pendant 45 minutes.
7. Après, centrifuger les tubes à 200g pendant 4 minutes et aspirer à la solution de bloc. Re-suspendre les cellules dans 1 ml de la solution d'anticorps primaire (faite avec la solution de bloc à la dilution recommandée). Les cellules peuvent être soit mis à incuber à température ambiante pendant 1 heure ou à 4 ° C pendant une nuit avant de passer à l'étape suivante.
8. Les cellules sont ensuite lavées deux fois avec 1 ml de solution de bloc.
9. Après, rétablir la suspension des cellules dans 1 ml de solution d'anticorps secondaire (faite avec la solution de bloc à la dilution recommandée) et incuber à température ambiante pendant 1 heure.
10. Après 1 heure, les cellules doivent ensuite être lavés à nouveau deux fois avec 1 ml de solution de bloc.
11. Après lavage avec une solution Block, laver les cellules à nouveau avec 1ml de PBS -.
12. Après les différents lavages, rétablir la suspension des cellules dans 1 ml de DAPI colorant nucléaire (1:10.000 dilution du DAPI dans PBS -) et incuber à température ambiante pendant 5 minutes.
13. Après 5 minutes, centrifuger les tubes à 200g pendant 4 minutes. Aspirer le DAPI solution de colorant nucléaire et de remettre en suspension les cellules dans 1ml de PBS -.

Incorporation de hPSCs dans les diapositives générées par un appareil cytospin: Partie 2

1. Diapositives en plastique sont préparés en faisant la quantité désirée de trous dedans avec une perceuse. Le diamètre doit être au plus 1 mm plus grand que le diamètre le plus large de la pointe micropipette (s) à être utilisé.
2. Le papier filtre est coupé à des paramètres de la glissière en plastique avec des ciseaux.
3. Les trous sont ensuite réalisés dans le papier filtre. La taille du trou (s) doit être assez grand pour que la pointe de micropipette (s) se range à travers elle.
4. Après, l'une des diapositives préparées en plastique est placé sur le dessus et une lame de verre dans placées au bas du papier filtre coupe (figure 1). Les couches sont sécurisés avec du ruban adhésif.
5. Un maximum de 100 ul (selon la densité désirée monocouche) de la suspension cellulaire teinté de la Partie 1 est ensuite placée dans le haut de la pointe micropipette (s).
6. Si nécessaire, l'appareil avec une solution de cellules peuvent être pesés et un contrepoids de poids similaire créé.
7. L'appareil cytospin et contrepoids peuvent sont ensuite placés dans une centrifugeuse de bureau et centrifugé à 200g pendant 4 minutes.
8. Après centrifugation, l'appareil est soigneusement démonté cytospin d'une manière qui ne marche pas déloger les cellules de la lame de verre.
9. Si nécessaire, l'excès entourant PBS - sur le côté verre dans aspirés hors.
10. Les cellules peuvent ensuite être visualisées en utilisant un microscope à fluorescence pour vérifier si la monocouche cellulaire désiré a été atteint.

Partie 3: montage diapos

1. Une goutte de la presse de montage souhaité est placé directement dans le centre de chaque zone contenant des cellules.
2. Après, une lamelle est doucement descendu sur les diapositives en essayant d'éviter les bulles d'air, si possible.
3. L'excès des médias de montage est ensuite retiré de diapositives.
4. Après, les côtés de l'lamelles sont scellées avec du vernis à ongle.
5. Les diapositives peuvent être conservés dans une zone de stockage dans le noir avant que les résultats sont observés et documentés.

Discussion

Aux fins de notre laboratoire, un plat de 35mm de cultures de cellules souches cultivées sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) est alloué pour la procédure de marquage immunocytochimique pour une utilisation avec l'appareil cytospin. Les cellules sont ensuite collectées par le biais du enzymatique repiquage, en supprimant autant de la couche MEF que possible, en une suspension à cellule unique. Si plus une isolation efficace de cellules souches à partir de la couche MEF est souhaitée, les colonies peuvent être manuellement repris ensuite digéré en suspension. Si les conditions d'alimentation libres sont utilisés dans la croissance des cellules souches des cultures, les colonies peuvent être simplement raclé et digéré en suspension. Alors une seule cellule initiale de la suspension est idéale, les grumeaux cellulaire devrait effectivement être décomposée à travers le lavage des nombreuses et re-suspension des mesures préconisées dans la procédure de coloration immunocytochimique.

La vidéo axé sur l'utilisation de marqueurs extracellulaire pour hPSCs coloration. Si coloration intracellulaire de la hPSCs est souhaitée, une étape supplémentaire avant l'ajout de la solution de bloc (étape 1.6) doit être fait dans laquelle les cellules sont lavées dans 1 ml de solution de perméabilisation (50ml de tampon de sel élevée avec 25 pi de Tween 20) à trois reprises avant de re-suspension eux Solution Block. Un autre point critique qui devrait être mentionné est que l'étape 1.9 de la procédure, des précautions doivent être prises pour réduire au minimum l'exposition de lumière pour les échantillons afin de prévenir le blanchiment de fluorescence de l'anticorps secondaire et DAPI colorant nucléaire.

En raison de la laver nombreux et re-suspension étapes de la procédure, tout un plat de 35mm avec une bonne quantité de passage prêts colonies de cellules souches, estimée d'avoir autour de 400k 600k-cellules, il est recommandé d'être digérés et utilisés dans la suspension initiale . Ceci est fait en prévision d'une perte cellulaire due à la nature de la procédure. Théoriquement, un montant beaucoup plus faible de cellules peuvent être utilisés dans la suspension initiale, mais un montant supplémentaire de soins doivent être prises afin de minimiser encore davantage la perte de cellules. Lors du chargement sur l'appareil cytospin après la procédure de coloration immunocytochimique, une densité cellulaire de 10k-50k est idéal. Il convient de mentionner que, alors que 100 ul est le montant maximal qui peut être chargée sur un appareil qui utilise un cytopsin 0.1μL 10 ul micropipette pointe, une plus petite quantité (environ 20 pi - 30μL) contenant la densité cellulaire idéal est recommandée. Cela minimise débordement inutile de liquide sur la lame de verre. Enfin, lorsque vous utilisez l'appareil cytospin avec la centrifugeuse, aussi longtemps que l'appareil est sécurisé par un mouvement latéral, la force créée par la centrifugeuse pendant la course a, à notre connaissance, été suffisantes à maintenir l'appareil de basculer ou de tomber.

Ingrédients pour les solutions utilisées dans la procédure immunocytochimiques:

1. Paraformaldéhyde à 2% (PFA) / saccharose à 2%
   1. Ajouter 75 ml d'eau distillée, et le placer sur la plaque chauffée mélanger à 56 ° C.
   2. Peser 2 g de PFA, et l'ajouter au récipient en verre.
   3. Peser 2 g de saccharose, et ajouter à l'IFP dans le récipient en verre.
   4. Ajouter 2 gouttes d'hydroxyde de sodium 1M.
   5. Une fois que tous les réactifs ont disparu dans la solution, ajouter 10 ml de PBS 10X + +.
   6. Ajuster le pH de la solution à 7,2-7,4.
   7. Montez le volume à 100 ml d'eau distillée.
      Conserver à 4 ° C et utiliser dans 1 semaine. Aliquotes peuvent être stockés à -20 ° C pendant 1 mois. Centrifuger brièvement après la décongélation de supprimer tout précipité.
2. Solution Block (10 ml)
   1. Ajouter 9,4 ml de PBS -.
   2. Ajouter 0,6 ml de sérum à l'PBS -. (Ce peut-être besoin d'être optimisé pour chaque anticorps.)
      Conserver à 4 ° C, et utiliser dans les 48 heures.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab Tek Permanox Chamber Slide	Thermo Fisher Scientific, Inc.	117437	Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μL Filter Tips	USA Scientific, Inc.	1121-3810
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280	Richard-Allan Scientific	8311-4	Mounting Medium
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	14190
Normal Goat Serum	Invitrogen	10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody	EMD Millipore	MAB4304	Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody	EMD Millipore	MAB4303	Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A11029	Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG	Invitrogen	A11006	Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride	Calbiochem	268298