Immunocytochemische analyse van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een Self-Made Cytospin Apparatuur

Summary

Opschorting immunocytochemische kleuring van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) voor het celoppervlak markers (SSEA-3/SSEA-4) werd bereikt op basis van het gebruik van een zelfgemaakte Cytospin apparaat tot een monolaag van cellen voor observatie en kwantificering te creëren.

Abstract

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) dat de menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) en de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) omvatten zijn spannende cel bronnen door hun grenzeloze zelfvernieuwing mogelijkheden en hun potentieel om te differentiëren in verschillende celtypes. De pluripotente toestand van hPSCs wordt meestal bepaald door technieken zoals qPCR, immunocytochemie, en door andere

Protocol

Deel 1: Vering immunocytochemische kleuringsprocedure

1. Cellen worden geoogst in een enkele celsuspensie.
2. De cellen worden vervolgens overgebracht naar 1.5-2 ml microcentrifugebuizen en gecentrifugeerd bij 200g gedurende 4 minuten.
3. Cellen worden gewassen door opzuigen uit supernatant, opnieuw gesuspendeerd in 1 ml PBS - (zonder Mg ^{2 +} en Ca ^{2 +)} en dan weer gecentrifugeerd bij 200g gedurende 4 minuten. Dit moet twee keer worden gedaan.
4. Na het wassen, worden de cellen vervolgens opgelost met een nieuwe schorsing ze in 1 ml van 4% paraformaldehyde (PFA) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
5. Cellen worden weer twee keer gewassen met 1 ml PBS -.
6. Na het wassen, blok cellen door re-schorsing ze in 1 ml van Block Solution (6% serum/94% PBS -). Incubeer deze bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten.
7. Na, centrifuge buizen op 200g voor 4 minuten en zuig uit Block Solution. Re-schorten cellen in 1 ml van het primaire antilichaam-oplossing (gemaakt met Block Solution in de aanbevolen verdunning). Cellen kunnen worden geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 1 uur of bij 4 ° C gedurende de nacht voordat u verder gaat met de volgende stap.
8. Cellen worden vervolgens tweemaal gewassen met 1 ml van Blok Solution.
9. Na opnieuw te schorten cellen in 1 ml van secundair antilichaam-oplossing (gemaakt met Block Solution in de aanbevolen verdunning) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
10. Na 1 uur, moeten cellen vervolgens tweemaal opnieuw worden gewassen met 1 ml van Blok Solution.
11. Na het wassen met Block Solution, opnieuw wassen cellen met 1 ml PBS -.
12. Na de verschillende gewassen, opnieuw te schorten cellen in 1 ml van DAPI nucleaire vlek (1:10.000 verdunning van DAPI in PBS -) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
13. Na 5 minuten, centrifugebuis bij 200g gedurende 4 minuten. Aspireren de DAPI nucleaire vlek oplossing en resuspendeer cellen in 1 ml PBS -.

Deel 2: Integratie van hPSCs in dia's gegenereerd door Cytospin apparatuur

1. Plastic dia's worden voorbereid door het maken van de gewenste hoeveelheid van gaten in hen met een boor pers. De diameter moet in de meeste 1mm groter is dan de grootste diameter van de micropipet tip (s) worden gebruikt.
2. Filtreerpapier wordt gesneden om de parameters van de kunststof glijbaan met een schaar.
3. Gaten worden vervolgens in het filtreerpapier. De grootte van het gat (s) moet groot genoeg zijn dat de micropipet tip (s) snuggly past doorheen.
4. Na, een van de bereide plastic dia's is bovenaan geplaatst en een glazen schuif geplaatst op de bodem van de cut filter papier (figuur 1). De lagen worden vastgezet met tape.
5. Een maximum van 100μL (afhankelijk van de gewenste monolaag dichtheid) van de gebrandschilderde celsuspensie uit deel 1 wordt dan geplaatst in de top van de micropipet tip (s).
6. Indien nodig kan het apparaat met een mobiele oplossing worden afgewogen en een tegenwicht van vergelijkbaar gewicht zijn gecreëerd.
7. De Cytospin apparaat en contra-evenwicht kan worden dan geplaatst in een desktop-centrifuge en gecentrifugeerd bij 200g gedurende 4 minuten.
8. Na het centrifugeren, is het Cytospin apparaat zorgvuldig uit elkaar gehaald op een manier die doesnt los van de cellen van het glaasje.
9. Indien nodig, teveel omringende PBS - op glas kant in geaspireerde uit.
10. Cellen kunnen vervolgens bekeken worden met behulp van een fluorescentie microscoop om te controleren of de gewenste cel monolaag is bereikt.

Deel 3: Montage dia's

1. Een druppel van de gewenste montage media is direct geplaatst in het midden van elk gebied met cellen.
2. Na, is een dekglas voorzichtig zakken op de dia's proberen om luchtbellen te vermijden indien mogelijk.
3. Overtollige montage media wordt vervolgens verwijderd uit dia's.
4. Na, zijn de zijkanten van de dekglaasjes verzegeld met nagellak.
5. De dia's kunnen worden bewaard in een donkere opslagruimte totdat de resultaten worden waargenomen en gedocumenteerd.

Discussion

Voor de toepassing van ons lab, is een 35mm gerecht van stamcellen culturen gekweekt op muis embryonale fibroblasten (MEF) toegewezen voor de immunocytochemische kleuring procedure voor gebruik met de Cytospin apparaat. De cellen worden vervolgens verzameld door middel van enzymatische passage, het verwijderen van zoveel mogelijk van de MEF laag als mogelijk, in een single-celsuspensie. Als er meer effectiever stamcellen isolatie van de MEF laag gewenst is, kan kolonies dan handmatig worden opgehaald verteerd in suspensie. Als feeder vrije omstandigheden worden gebruikt in het kweken van de stamcellen culturen, kan de kolonies eenvoudig worden afgeschraapt en verteerd in suspensie. Terwijl een eerste single-celsuspensie is ideaal, moet elke cellulaire klonten effectief van elkaar worden gebroken door de vele wassen en resuspensie stappen gevraagd in de immunocytochemische kleuringsprocedure.

De video gericht op het gebruik van extracellulaire markers voor kleuring hPSCs. Als intracellulaire kleuring van de hPSCs gewenst is, een extra stap vóór de toevoeging van Block Solution (stap 1.6) moet worden gedaan, waarin de cellen worden gewassen in 1 ml van permeabilisatie Solution (50mLs van High Salt Buffer met 25μL van Tween 20) drie keer alvorens opnieuw te schorten in Block Solution. Een ander kritisch punt dat moet worden vermeld is dat vanaf stap 1.9 in de procedure, de zorg moet worden genomen in het minimaliseren van de blootstelling aan het licht van de monsters naar fluorescentie bleken van het secundaire antilichaam en DAPI nucleaire vlekken te voorkomen.

Vanwege de vele wassen en resuspensie stappen in de procedure, een complete 35mm schotel met een goede hoeveelheid van passage-ready stamcellen kolonies, die naar schatting hebben ongeveer 400k-600K cellen, wordt aanbevolen om worden verteerd en gebruikt in de initiële suspensie . Dit gebeurt in afwachting van enkele cel verlies als gevolg van de aard van de procedure. Theoretisch kan een veel kleinere hoeveelheid cellen die worden gebruikt in de eerste schorsing, maar een extra hoeveelheid van de zorg moet worden genomen om verder te minimaliseren cel verlies. Bij het laden op de Cytospin apparaat na de immunocytochemische kleuringsprocedure, een cel dichtheid van 10k-50k is ideaal. Hierbij moet worden opgemerkt dat, terwijl 100μL is het maximum bedrag dat kan worden geladen op een cytopsin apparaat dat een 0.1μL 10μL micropipet tip gebruikt, een kleinere hoeveelheid (rond 20μL - 30μL) met de ideale celdichtheid wordt aanbevolen. Dit minimaliseert onnodige overloop van de vloeistof op het glaasje. Ten slotte, wanneer het gebruik van de Cytospin apparaat met de centrifuge, zolang het apparaat is beveiligd tegen zijwaartse beweging, de kracht die door de centrifuge tijdens het uitvoeren van heeft, om onze kennis, noodzakelijk is in het houden van het apparaat uit flippen of vallen uit.

Ingrediënten voor oplossingen die in de immunocytochemische procedure:

1. 2% paraformaldehyde (PFA) / 2% Sucrose
   1. Voeg 75 ml gedestilleerd water, en leg ze op verwarmde plaat roeren bij 56 ° C.
   2. Weeg 2 g PFA, en toe te voegen aan glazen beker.
   3. Weeg 2 g sucrose, en toe te voegen aan PFA in glazen beker.
   4. Voeg 2 druppels van 1M natriumhydroxide.
   5. Zodra alle reagentia zijn gegaan in de oplossing, voeg 10 ml van 10X PBS + +.
   6. Breng de pH van de oplossing 7,2-7,4.
   7. Breng het volume tot 100 ml met gedestilleerd water.
      Bewaren bij 4 ° C, en binnen 1 week. Porties kunnen worden opgeslagen @ -20 ° C gedurende 1 maand. Centrifugeer kort na het ontdooien op een neerslag te verwijderen.
2. Block Solution (10 ml)
   1. Voeg 9,4 ml PBS -.
   2. Voeg 0,6 ml serum voor de PBS -. (Dit moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor elk antilichaam.)
      Bewaren bij 4 ° C, en het gebruik binnen 48 uur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab Tek Permanox Chamber Slide	Thermo Fisher Scientific, Inc.	117437	Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μL Filter Tips	USA Scientific, Inc.	1121-3810
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280	Richard-Allan Scientific	8311-4	Mounting Medium
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	14190
Normal Goat Serum	Invitrogen	10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody	EMD Millipore	MAB4304	Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody	EMD Millipore	MAB4303	Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A11029	Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG	Invitrogen	A11006	Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride	Calbiochem	268298