Summary
إنشاء نموذج الفأر الجرثومي المزمن المصابين الثابتة
Abstract
البكتيرية نموذج الفأر المصاب نظام نموذجي قوية لدراسة مجالات مثل الالتهابات والعدوى ، وعلم المناعة ، ونقل الإشارة ، وتكون الأورام. وقد اتخذت العديد من الباحثين الاستفادة من الناجم عن التهاب القولون
Protocol
هذا البروتوكول يتضمن ثلاثة أجزاء : الثقافة البكتيرية ، بالتزقيم الماوس ، والكشف عن السالمونيلا.
1. السالمونيلا حالة نمو.
- تعد السالمونيلا لوريا ، Bertani مرق (LB) لوحة ، واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
- اختيار استنساخ من لوحة ووضعها موضع LB LB 7 مل في أنبوب 12 مل ، ويهز في 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعات تقريبا.
- تلقيح 50 مل LB مع 0.05 مل من ثقافة المرحلة الثابتة واحتضان على 37 درجة مئوية دون أن تهتز لمدة 18 ساعة تقريبا.
- تدور ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة مع 6000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة ، ووقف البكتيريا في HBSS باستخدام نسبة 100:3 (LB : HBSS). على سبيل المثال :
وسيتم تعليق كل ثقافة LB 50 مل في HBSS مل 1.5. - لبالتزقيم الحيوانية ، كذلك تمييع ثقافة البكتيرية في نسبة 1:10. على سبيل المثال :
وسيتم تعليق كل LB 1.5 مل الثقافة في HBSS 15 مل.
2. السالمونيلا عدوى النموذج *.
- إعداد الحل الستربتوميسين. وسيتم منح كل من الماوس 7.5 ملغ في 100 الستربتوميسين HBSS ميكرولتر. على سبيل المثال ، تعد حوالي 90 ملغ من الستربتوميسين في 1.2 مل لمدة 10 HBSS الفئران. دائما بعض وحدات التخزين الإضافية عند إعداد حل الستربتوميسين.
- سحب المياه والغذاء 4 ساعات قبل العلاج بالتزقيم عن طريق الفم.
- بالتزقيم الفئران مع الستربتوميسين مع 7.5 ملغ من ستربتوميسين (100 ميكرولتر من HBSS للسيطرة الفئران). الاستيلاء على الجلد على الكتف الماوس بحزم مع الابهام والاصبع الوسطى ، وتمتد على الرأس والرقبة مع السبابة لجعل المرء على التوالي. توجيه الكرة رأس الإبرة التغذية على طول سقف الفم ، ونحو الجانب الأيمن من الجزء الخلفي من البلعوم ، ثم تمرير برفق الى اسفل المريء وحقن محلول 100 ميكرولتر. وينبغي أن يشعر أي مقاومة.
- في 20 ساعة بعد تلقي العلاج الستربتوميسين ، سحب المياه والمواد الغذائية مرة أخرى قبل أن يصاب في الفئران مع البكتيريا.
- بالتزقيم كل الفأر مع 100 تعليق ميكرولتر في HBSS أو تعامل مع HBSS العقيمة (مراقبة) بواسطة التغذية عن طريق الفم. الإجراء بالتزقيم هو نفس 2.3) مع الفئران بالتزقيم الستربتوميسين.
وقد أجريت التجارب باستخدام الحيوانات * محددة الممرض خالية C57BL الإناث / 6 الفئران (Taconic ، هدسون ، نيويورك) التي كانت 6-7 أسابيع من العمر كما هو موضح سابقا 1. تمت الموافقة على البروتوكول من جامعة روتشستر جامعة جنة الموارد الحيوانية (UCAR).
3. الكشف عن السالمونيلا في الأمعاء.
- جمع الماوس برازي (حوالي 100 ملغ).
- نقل عينة البراز إلى 1.5 أنبوب الطرد المركزي صغيرة مع PBS 1ml ودوامة بقوة.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 800 دورة في الدقيقة. نقل طاف في أنبوب microfuge نظيفة.
- الطرد المركزي عند 6000 دورة في الدقيقة ل5min. يتم تجاهل طاف برنامج تلفزيوني و 200 ميكرولتر يضاف إلى الكريات وvortexed.
- 200 خط في برنامج تلفزيوني مع ميكرولتر مفرشة الخلية المتاح على طبق من ذهب CHROMagar BBL للكشف عن السالمونيلا. أنواع السالمونيلا تظهر خبازي (رفعت إلى اللون الأرجواني ، انظر Fig.1). إذا غلة 200 ميكرولتر مستعمرات كثيرة جدا على لوحة ، أو استخدام 100 ميكرولتر 50 ميكرولتر لمتتالية.
4. ممثل النتائج.
عندما يتم بشكل صحيح للبروتوكول ، ويمكن الكشف عن السالمونيلا التيفية الفأرية الاستعمار في الأمعاء الماوس أكثر من 6 أشهر. السالمونيلا يمكن الكشف عنها بواسطة البراز الثقافة أكثر من 6 أشهر (Fig.1). ويأتي خارجا نموذجية من هذا الطراز ، فقدان وزن الجسم وفاة تحدث في غضون 4 أسابيع بعد الإصابة. تعتمد على استخدام سلالات السالمونيلا للعدوى ، قد يكون بعض الفئران البقاء على قيد الحياة لا أكثر من 6 أشهر.
الشكل 1. السالمونيلا المعوية في أنواع السالمونيلا تظهر خبازي (ارتفع إلى الأرجواني) في اللون ، وذلك بسبب الاختلافات في التمثيل الغذائي وجود chromogens المحدد. اما الانواع الاخرى من البكتيريا أو كبح انتاج مستعمرات الأخضر والأزرق أو اللون.
الشكل 2. نسب بقاء الفئران المصابة بالسالمونيلا سلالة طافرة PhoP ج ، ج PhoP AvrA ، وPhoP AvrA-/AvrA ج + ، ج PhoP AvrA لمدة 4 أسابيع (28 يوما).
وزن الجسم الجدول 1. الفئران المصابة بالسالمونيلا لمدة 4 أسابيع.
| 0 | 1 أسبوع | 2 أسابيع | 3 أسابيع | 4 أسابيع | |
| مراقبة | 16.78 ± 1.05 | 16.91 ± 1.28 | 18.26 ± 1.23 | 19.31 ± 1.26 | 20.26 ± 1.15 |
| ج PhoP 16.89 ± 1.03 | 17.14 ± 1.19 | 17.43 ± 1.63 * | 18.68 ± 1.78 | 20.05 ± 1.11 | |
| ج PhoP AvrA - | 16.91 ± 1.12 | 16.96 ± 1.39 | 17.06 ± 2.14 ** | 18.71 ± 2.18 | 20.15 ± 1.56 |
| ج + PhoP AvrA-/AvrA | 16.94 ± 0.96 | 17.17 ± 1.02 | 17.63 ± 1.42 * | 18.44 ± 2.03 | 20.09 ± 1.17 |
* مقارنة مع مجموعة مراقبة ع <0.05
** مقارنة مع مجموعة مراقبة ع <0.01
الجدول 2. سلالات السالمونيلا المستخدمة في هذه الدراسة.
| اسم | وصف | مرجع أو مصدر |
| السالمونيلا 14028s | البرية من نوع س. التيفية الفأرية | ATCC |
| ج PhoP | غير منظم الإمراض معقدة متحولة | ميلر وآخرون ، 1990 |
| ج PhoP AvrA - | AvrA - الطفرة | كولير ، Hyams وآخرون ، 2002 |
| ج + PhoP AvrA-/AvrA | ج PhoP AvrA - مع استكمال AvrA ترميز البلازميد | كولير ، Hyams وآخرون ، 2002 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لاستخدام هذا النظام ، فإنه من الضروري للباحث أن تتعلم كيف للتسمين الحيوانات. نحن بالتفصيل منهجية لإعداد ثقافة البكتيرية وبالتزقيم الفئران. علينا أن نبين كيفية مراقبة استمرار السالمونيلا في القناة (GI) الهضمي. الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول بما في ذلك :
- الستربتوميسين - المعالجة : المعالجة يمكن الستبرتوميسين - التخلص من بعض النباتات المتعايشة الأمعاء وجعل الفئران عرضة للعدوى السالمونيلا 2.
- السالمونيلا بالتزقيم : للمبتدئين ، ويمكن أن يشكل تحديا بالتزقيم. في وقت ما ، بالتزقيم يفشل لأن يتم حقن بطريق الخطأ حل لمجرى الهواء ويسبب الوفاة الماوس.
- الاستعمار الجرثومي الثابتة : ضرورة إغلاق البكتيريا الرصد في الجهاز الهضمي. بالإضافة إلى ثقافة الماوس البراز ، ويمكن أيضا محتويات الأعور أن تستخدم للكشف عن السالمونيلا في لوحات CHROMagar BBL. جمع محتويات الأعور عندما يتم التضحية الفئران بعد الاصابة السالمونيلا.
لقد اختبرنا الاستعمار السالمونيلا في الماوس في تركيز مختلفة : 1 × 10 3 مستعمرة تشكيل وحدات ل1 × 10 وحدات لتشكيل مستعمرة 8 (100 ميكرولتر / الماوس). في 1 × 06-10 أكتوبر 8 × 10 مستعمرة تشكيل وحدات ، والسالمونيلا قادرة على استعمار الفئران. ولذلك ، استنادا منشوراتنا السابقة 1 و 5 و بيانات غير منشورة ، لن تركيز النهائي من السالمونيلا في هذا الحل يمكن قياسها قبل تسمين.
في هذا الإجراء التجريبي ، استخدمنا محددة الممرض خالية C57BL الإناث / 6 الفئران (Taconic ، هدسون ، نيويورك) التي كانت 6-7 أسابيع من العمر. وتشمل استخدام سلالات بكتيرية السالمونيلا التيفية الفأرية ATCC14028s سلالة البرية من نوع (WT - SL) ، غير الممرضة السالمونيلا سلالة طافرة PhoP C3 ، PhoP ج AvrA ، وPhoP AvrA-/AvrA ج + ، ج PhoP AvrA (الجدول 2). باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن الكشف عن السالمونيلا التيفية الفأرية الاستعمار في الأمعاء الماوس أكثر من 6 أشهر (Fig1). قيست عدوى السالمونيلا والالتهاب من خلال مراقبة البراز والوزن الصبي. عندما تم جمع عينات من الأنسجة والدم ، وقياس طول الأمعاء كسمة من التهاب في الامعاء. ودرست أيضا في أوزان الكبد والطحال. تم اختبار المصل الماوس خلوى بواسطة ELISA5. وتستخدم أساليب أخرى أكثر على مزيد من الحيوية والجزيئية لاختبار التغيرات في خلوى التهابات والتغيرات الناجمة عن أمراض السالمونيلا 5.
عادة ، الجسم وفقدان الوزن وتحدث الوفاة في غضون 4 أسابيع بعد العدوى (الجدول 1). عدوى السالمونيلا آخر ، كان هناك نقص ملحوظ في وزن الجسم في محاربة الجماعات المصابة البكتيرية مقارنة مع مجموعة مراقبة من دون علاج البكتيريا (* P <0.05 أو ع <0.001 الجدول 1). وقد تم قياس وزن الجسم أسبوعيا. وأظهرت نسب البقاء على قيد الحياة بعد 4 أسابيع العدوى في الشكل. 2. عموما ، 92 ٪ من الفئران (ن = 50) مصابا PhoP سلالات السالمونيلا ج ، و 78 ٪ PhoP AvrA ج ، أو 70 ٪ PhoP AvrA-/AvrA ج + يمكن أن يعيش مع السالمونيلا المستمرة في الأمعاء. بعد العدوى الحادة ، وجميع الناجين مازال يحمل السالمونيلا ، التي يمكن أن يتم الكشف عن الإصابة بفيروس آخر 6 أشهر باستخدام الطريقة الموصوفة في هذا الاقتراح. اكتسبت الفئران الفئران البقاء على قيد الحياة مرة واحدة 3 أسابيع العدوى آخر ، ووزن الجسم وأقل حدوث الوفاة (Fig.2). وعلاوة على ذلك ، والبيانات تظهر أيضا تلطيخ immunofluroscence غزو السالمونيلا في الغشاء المخاطي المعوي 27 إصابة آخر أسابيع (Fig.3). وأظهرت هذه البيانات أن PhoP ج ، ج PhoP AvrA ، أو PhoP AvrA-/AvrA ج + يمكن استخدامها لنموذج عدوى مزمنة.
الفئران مع عامل مقاومة المضيف Nramp1 + / + مقاومة للعدوى السالمونيلا 3-6. C57/BL6 الفئران مع Nramp معيبة استخدامها في الدراسات الحالية. وجدنا أن 90 ٪ الفئران المصابة بالسالمونيلا الإمراض 14028s سلالة لا يمكن البقاء على قيد الحياة لأكثر من 4 أسابيع (لا تظهر البيانات). لفهم الآثار الطويلة الأمد للعدوى من النوع البري التيفية الفأرية S. ، يمكن أن الفئران مع Nampr1 + / + استخدامها.
تم تأسيس هذا النموذج في مختبر BSL - 2. تمت الموافقة على بروتوكول لدينا من جامعة روتشستر جامعة جنة الموارد الحيوانية (UCAR). الفئران المصابة بالسالمونيلا من المرجح أن تعاني الانزعاج والضيق وتصبح أقل نشاطا والتحرك ببطء. قد تصبح فرائها تكدرت وأنها قد لا الأعلاف أو تشرب كالمعتاد. وسيتبع هذه الحيوانات عن كثب وإذا كان أي علامة على عدم الراحة مثل قادر على ambulate جيدا بما فيه الكفاية للحفاظ على الماء والسعرات الحرارية وإذا أظهر مؤشر الفأرة أنه يستنشق السائل أو نقص ملحوظ في وزن الجسم (10 ٪ أو أكثر) 7 ، وفعل وكان لا يموت فورا ، الموت الرحيم إنسانية الماوس. وسيتم تدريب جميع العاملين في المختبرات فيمراقبة الفئران مناسب 8 و 9.
تستخدم العديد من الدراسات والستربتوميسين ، المعالجة قد استفادت من التهاب القولون الناجم عن السالمونيلا التيفية الفأرية للدراسات حول في مرحلة مبكرة من العدوى 1،2،10. لكن التقرير سوى عدد قليل من حالات العدوى المزمنة في نموذج الفأر في الجسم الحي 11. الفئران مع وجود السالمونيلا المستمرة في الجهاز الهضمي تتيح لنا استكشاف المضيف للبكتيريا على المدى الطويل التفاعل ونقل الإشارة ، وتكون الأورام. أنشأنا الجرثومي المزمن نموذج الفأر المصاب السالمونيلا التيفية الفأرية مع الاستعمار في الأمعاء الماوس أكثر من 6 أشهر. ويمكن أيضا أن يستخدم هذا النموذج لالمرضية القولونية والدراسات البروبيوتيك. عموما ، فإن هذا البروتوكول المساعدات الباحثون باستخدام نموذج الفأر لمعالجة المسائل ذات الأهمية الأساسية البيولوجية والميكروبيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل عن طريق منح جوائز كبيرة DK075386 KO1 وجمعية السرطان الاميركية RSG - 09 - 075 - 01 - MBC لأحد يونيو
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma-Aldrich | ABCD1234 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Streptomycin | MP Biomedicals | 100556 | |
| BBL CHROMagar Salmonella | BD Biosciences | 214983 | |
| Disposable cell spreaders | Biologix Research Company | 65-1010 |
References
- Duan, Y. beta-Catenin activity negatively regulates bacteria-induced inflammation. Lab Invest. 87 (6), 613-624 (2007).
- Barthel, M. Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host. Infection and immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).
- Miller, S. I., Mekalanos, J. J. Constitutive expression of the phoP regulon attenuates Salmonella virulence and survival within macrophages. Journal of bacteriology. 172 (5), 2485-2490 (1990).
- Valdez, Y. Nramp1 expression by dendritic cells modulates inflammatory responses during Salmonella Typhimurium infection. Cell Microbiol. 10 (8), 1646-1661 (2008).
- Woo, H., Okamoto, S., Guiney, D., Gunn, J. S., Fierer, J. A model of Salmonella colitis with features of diarrhea in SLC11A1 wild-type mice. PLoS ONE. 3 (2), e1603-e1603 (2008).
- Dangl, J. L. Molecular call-and-response: how Salmonella learns the gospel from its host. Trends Microbiol. 11 (6), 245-246 (2003).
- Zaharik, M. L., Vallance, B. A., Puente, J. L., Gros, P., Finlay, B. B. Host-pathogen interactions: Host resistance factor Nramp1 up-regulates the expression of Salmonella pathogenicity island-2 virulence genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 15705-15710 (2002).
- Townsend, P., Morton, D. B. Laboratory Animal Care Policies and Regulations: United Kingdom. ILAR J. 37 (2), 68-74 (1995).
- Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane endpoints for infectious disease animal models. ILAR J. 41 (2), 99-104 (2000).
- Ye, Z., Petrof, E. O., Boone, D., Claud, E. C., Sun, J. Salmonella effector AvrA regulation of colonic epithelial cell inflammation by deubiquitination. Am J Pathol. 171 (3), 882-892 (2007).
- Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K. S., Vallance, B. A., Finlay, B. B. Chronic enteric salmonella infection in mice leads to severe and persiste nt intestinal fibrosis. Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).
- Sukupolvi, S., Edelstein, A., Rhen, M., Normark, S. J., Pfeifer, J. D. Development of a murine model of chronic Salmonella infection. Infection and immunity. 65 (2), 838-842 (1997).
- Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. (2007).
- Wu, S., Lu, R., Zhang, Y., Sun, J. Chronic effects of a Salmonella type III secretion effector protein AvrA in vivo. PLoS ONE. , Forthcoming (2010).
