Summary
Stellen Sie eine chronische bakterielle Infektion Mausmodell mit persistierenden
Abstract
Die bakterielle Infektion Mausmodell ist ein leistungsfähiges Modell für die Erforschung von Bereichen wie Infektion, Entzündung, Immunologie, Signaltransduktion und Tumorgenese. Viele Forscher haben den Vorteil der Colitis induziert durch genommen
Protocol
Dieses Protokoll umfasst drei Teile: Bakterienkultur, Maus Magensonde und Nachweis von Salmonellen.
1. Salmonella Wachstum Zustand.
- Bereiten Sie die Salmonella Luria-Bertani Broth (LB)-Platte, bei 37 ° C über Nacht inkubieren.
- Wählen Sie einen Klon aus der LB-Platte und in 7 ml LB in einer 12 ml-Tube, und schütteln bei 37 ° C für ca. 5 Stunden.
- Inoculate 50 ml LB mit 0,05 ml einer stationären Phase der Kultur und bei 37 ° C ohne Schütteln für etwa 18 Stunden.
- Spin Nacht Bakterienkultur bei Raumtemperatur mit 6000 rpm für 10 Minuten auszusetzen, die Bakterien in HBSS mit Verhältnis 100:3 (LB: HBSS). Zum Beispiel:
Jede 50 ml LB-Kultur wird in 1,5 ml HBSS suspendiert werden. - Für das Tier Magensonde weiter verdünnen, der Bakterienkultur bei 1:10-Verhältnis. Zum Beispiel:
Jede 1,5 ml LB-Kultur wird in 15 ml HBSS suspendiert werden.
2. Salmonellen-Infektion Modell *.
- Bereiten Sie den Streptomycin-Lösung. Jede Maus wird 7,5 mg Streptomycin in 100 ul HBSS gegeben werden. Zum Beispiel, bereiten insgesamt 90 mg Streptomycin in 1,2 ml HBSS für 10 Mäuse. Immer etwas mehr Volumen bei der Vorbereitung des Streptomycin-Lösung.
- Ziehen Sie Wasser und Essen 4 Stunden vor orale Gabe Behandlung.
- Gavage Mäuse mit Streptomycin mit 7,5 mg Streptomycin (100 ul HBSS für Kontroll-Mäuse). Besorgen Sie sich die Haut über der Maus Schulter fest mit dem Daumen und Mittelfinger, strecken den Kopf und Hals mit dem Zeigefinger an der Speiseröhre gerade machen. Richten Sie die Kugel-Spitze der Fütterung Nadel auf dem Dach des Mundes und auf der rechten Seite der Rückseite des Rachens, dann vorsichtig Pass hinunter in die Speiseröhre und injizieren Sie die 100 ul Lösung. Kein Widerstand sollte zu spüren sein.
- Bei 20 Stunden nach der Streptomycin-Behandlung, zurückgezogen Wasser und Nahrung wieder, bevor die Mäuse mit Bakterien infiziert sind.
- Gavage jeder Maus mit 100 ul Suspension in HBSS behandelt oder mit sterilem HBSS (Kontrolle) durch orale Gabe. Die Magensonde Verfahren ist das gleiche wie 2,3) Magensonde Mäuse mit Streptomycin.
* Tierversuche wurden unter Verwendung spezifischer-Pathogen-freien weibliche C57BL / 6 Mäuse (Taconic, Hudson, NY), die 6-7 Wochen alt waren wie zuvor 1 beschrieben durchgeführt. Das Protokoll wurde von der University of Rochester University Committee on Animal Resources (UCAR) zugelassen.
3. Nachweis von Salmonellen in Darm.
- Sammeln Sie mit der Maus Kot (ca. 100 mg).
- Transfer Stuhlprobe in ein 1,5 Mikro-Zentrifugenröhrchen mit 1 ml PBS und kräftig vortexen.
- Zentrifuge für 10 min bei 800 Umdrehungen pro Minute. Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen.
- Zentrifugation bei 6000 rpm für 5min. Überstand wird verworfen und 200 ul PBS ist es, die Pellets zugegeben und gevortext.
- Streak die 200 ul PBS mit einem Einweg-Zell-Streuer auf einer BBL CHROMagar Platte Salmonellen zu erkennen. Salmonellen erscheinen mauve (rosa bis violett, siehe Abb.1). Wenn 200 ul liefert zu viele Kolonien auf der Platte, verwenden Sie 100 ul oder 50 ul für den Streifen.
4. Repräsentative Ergebnisse.
Wenn das Protokoll korrekt geschehen ist, kann Salmonella typhimurium Kolonisierung in der Maus Darm mehr als 6 Monaten nachgewiesen werden. Salmonellen könnten durch fäkale Kultur über 6 Monate (Abb. 1) festgestellt werden. Als typisches aus diesem Modell kommen, wiegen Körper Verlust und Tod auftreten innerhalb von 4 Wochen nach der Infektion. Abhängig von der Salmonella-Stämme zur Infektion verwendet, können einige Mäuse nicht mehr als 6 Monate überleben.
Abbildung 1. Intestinal Salmonellen in der Salmonella-Spezies erscheinen mauve (rosa bis violett) in Farbe, durch metabolische Unterschiede in der Gegenwart von ausgewählten Chromogene. Andere Bakterien sind entweder gehemmt oder produzieren blau-grüne oder farblose Kolonien.
Abbildung 2. Survival-Anteile von Mäusen mit Salmonella Mutante PhoP c, c PhoP infiziert Avra-und PhoP c AvrA-/AvrA +, PhoP c Avra für 4 Wochen (28 Tage).
Tabelle 1. Körpergewicht von Mäusen mit Salmonella für 4 Wochen infiziert.
| 0 | 1 Woche | 2 Wochen | 3 Wochen | 4 Wochen | |
| Kontrolle | 16,78 ± 1,05 | 16,91 ± 1,28 | 18,26 ± 1,23 | 19,31 ± 1,26 | 20,26 ± 1,15 |
| PhoP c 16,89 ± 1,03 | 17,14 ± 1,19 | 17,43 ± 1,63 * | 18,68 ± 1,78 | 20,05 ± 1,11 | |
| PhoP c Avra- | 16,91 ± 1,12 | 16,96 ± 1,39 | 17,06 ± 2,14 ** | 18,71 ± 2,18 | 20,15 ± 1,56 |
| PhoP c AvrA-/AvrA + | 16,94 ± 0,96 | 17,17 ± 1,02 | 17,63 ± 1,42 * | 18,44 ± 2,03 | 20,09 ± 1,17 |
* Im Vergleich zu der Kontrollgruppe p <0,05
** Im Vergleich zu Gruppe p <0,01 Kontrolle
Tabelle 2. Salmonella-Stämme in dieser Studie verwendet.
| Name | Beschreibung | Referenz oder Quelle |
| Salmonella 14028s | Wild-Typ S. typhimurium | ATCC |
| PhoP c | Non-pathogenen Komplexes Regulator-Mutanten | Miller et al., 1990 |
| PhoP c Avra- | Avra-Mutation | Collier-Hyams et al., 2002 |
| PhoP c AvrA-/AvrA + | PhoP c Avra-mit ergänzt Plasmid kodiert Avra | Collier-Hyams et al., 2002 |
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Discussion
Zur Nutzung dieses Systems ist es notwendig, für den Forscher lernen, wie man die Tiere eine Magensonde. Wir Detail eine Methodik für die Vorbereitung Bakterienkultur und Magensonde die Mäuse. Wir zeigen auch, wie die Salmonellen Persistenz im Magen-Darm (GI-Trakt) zu überwachen. Die kritischen Schritte in diesem Protokoll einschließlich:
- Streptomycin-Vorbehandlung: Streptomycin-Vorbehandlung loswerden könnte einige kommensalen Darmflora und machen die Mäuse anfällig für die Infektion mit Salmonellen 2.
- Salmonella Magensonde: für den Anfänger, der Magensonde konnte eine Herausforderung sein. Irgendwann, schlägt eine Magensonde, weil die Lösung versehentlich auf die Atemwege injiziert und bewirkt Maus Tod.
- Persistent bakterielle Besiedlung: brauchen eine engmaschige Überwachung Bakterien im Magen-Darm-Trakt. Neben Maus fäkale Kultur, können Inhalte der Blinddarm auch für den Nachweis von Salmonellen in BBL CHROMagar Platten verwendet werden. Sammeln Blinddarm Inhalt, wenn Mäusen nach Infektion mit Salmonellen geopfert werden.
Wir haben die Salmonellen Kolonisation in der Maus getestet unterschiedlicher Konzentration: 1 x 10 3 Kolonie-bildenden Einheiten auf 1 x 10 8 Kolonie-bildenden Einheiten (100 ul / Maus). Bei 1 x 06 bis 10 Oktober x 10 8 koloniebildende Einheiten wurden Salmonellen in der Lage, die Mäuse zu kolonisieren. Daher basieren auf unseren bisherigen Publikationen 1, 5 und unveröffentlichte Daten, wird die endgültige Konzentration von Salmonellen in dieser Lösung nicht vor Magensonde gemessen werden.
In diesem experimentellen Verfahren haben wir spezifische-Pathogen-freien weibliche C57BL / 6 Mäuse (Taconic, Hudson, NY), die 6-7 Wochen alt waren. Verwendete Bakterienstämme gehören Salmonella typhimurium Wildtypstamm ATCC14028s (WT-SL), nicht-pathogenen Salmonellen Mutante PhoP c3, PhoP c Avra-und PhoP c AvrA-/AvrA +, PhoP c Avra (Tabelle 2). Über dieses Protokoll können Salmonella typhimurium Kolonisierung in der Maus Darm mehr als 6 Monaten (Abb. 1) nachgewiesen werden. Salmonellen-Infektion und Entzündung, die durch die Beobachtung Fäkalien und Jungen Gewicht gemessen. Wenn Gewebeproben und Blut gesammelt wurden, war die Länge des Darms als Merkmal der Darmentzündung gemessen. Die Gewichte der Milz und Leber wurden ebenfalls untersucht. Maus Serum-Zytokin wurden von ELISA5 getestet. Des weiteren, biochemischer und molekularer Methoden werden weiter verwendet, um die Änderungen von entzündlichen Zytokinen und Pathologie Veränderungen durch Salmonella 5 induzierte testen.
In der Regel treten Gewichtsverlust und Tod innerhalb von 4 Wochen nach der Infektion (Tabelle 1). Beitrag Salmonellen-Infektion, gab es erhebliche Verlust an Körpergewicht in die bakterielle Infektion Gruppen im Vergleich zu der Kontrollgruppe ohne bakterielle Behandlung (* p <0,05 bzw. p <0,001 Tabelle 1). Das Körpergewicht wurde wöchentlich gemessen. Das Überleben Proportionen 4 Wochen nach der Infektion wurden in Abb.. 2. Insgesamt 92% der Mäuse (n = 50) mit Salmonella-Stämme PhoP c infiziert, 78% PhoP c Avra-, bzw. 70% PhoP c AvrA-/AvrA + kann mit persistierenden Salmonellen im Darm überleben. Nach der akuten Infektion, alle Überlebenden noch durchgeführt Salmonellen, die konnten nach der Infektion nachgewiesen werden 6 Monate nach dem Verfahren in diesem Vorschlag beschrieben. Sobald Mäusen 3 Wochen nach der Infektion überleben, gewann Mäuse Körpergewicht und weniger der Tod eingetreten ist (Abb. 2). Darüber hinaus immunofluroscence Färbung Daten zeigen auch die Invasion von Salmonella in Darmschleimhaut 27 Wochen nach der Infektion (Abb. 3). Diese Daten zeigten, dass PhoP c, c PhoP Avra-oder PhoP c AvrA-/AvrA + kann für die chronische Infektion Modell verwendet werden.
Mäuse, die mit Host-Resistenz Faktor Nramp1 + / + sind resistent gegen Salmonellen-Infektion 3-6. C57/BL6-Mäusen mit NRAMP defekt waren in der aktuellen Studien. Wir fanden, dass 90% Mäuse, die mit pathogenen Salmonellen-Stamm infiziert 14028s kann nicht über 4 Wochen (Daten nicht gezeigt) zu überleben. Um zu verstehen, die langfristigen Auswirkungen von Wildtyp-S. Typhimurium-Infektion, Mäuse mit Nampr1 + / + verwendet werden könnte.
Dieses Modell ist in einem BSL-2-Labor gegründet. Unser Protokoll wird von der University of Rochester University Committee on Animal Resources (UCAR) zugelassen. Mäuse, die mit Salmonellen infiziert sind wahrscheinlich zu Unbehagen und Stress leiden und weniger aktiv und bewegen sich langsam. Ihr Fell kann sich gesträubt und sie dürfen nicht füttern oder zu trinken, als normal. Die Tiere werden genau beobachtet werden, und wenn Anzeichen von Beschwerden wie nicht gut genug ambulate auf Hydratation und Kalorienaufnahme zu halten, wenn eine Maus zeigte Anzeichen dafür, dass es hatte Flüssigkeit oder signifikanten Gewichtsverlust (10% oder mehr) 7 angesaugt und tat nicht sofort sterben, war die Maus human eingeschläfert. Alle Labor-Personal wird in trainiert werdenBeobachtung der Mäuse entsprechend 8, 9.
Viele Studien der Streptomycin-Vorbehandlung wurden Vorteil der colitis von Salmonella typhimurium für die Studien über die frühe Phase der Infektion 1,2,10 induzierte genommen. Doch nur wenige über die chronische Infektion in der Maus-Modell in vivo 11. Mäuse, die mit Salmonellen anhaltende Existenz in der GI-Trakt erlauben uns, die langfristige Wirt-Bakterien-Interaktion, der Signaltransduktion und Tumorgenese zu erkunden. Wir haben eine chronische bakterielle Infektion Mausmodell mit Salmonella typhimurium Kolonisierung in der Maus Darm über 6 Monate festgelegt. Dieses Modell kann auch für E.coli Pathogenese und Probiotika Studien verwendet werden. Insgesamt wird dieses Protokoll Hilfe Forscher mit der Maus-Modell grundlegend wichtig, biologischen und mikrobiologischen Fragen zu beantworten.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der NIDDK KO1 DK075386 gewähren und die American Cancer Society RSG-09-075 bis 01-MBC bis Jun Sun unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma-Aldrich | ABCD1234 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Streptomycin | MP Biomedicals | 100556 | |
| BBL CHROMagar Salmonella | BD Biosciences | 214983 | |
| Disposable cell spreaders | Biologix Research Company | 65-1010 |
References
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