Summary
הקמנו מודלים של העכבר לויקומלציה periventricular (PVL), את הפגיעה במוח השולט על פגים מאופיין periventricular נגעים בחומר הלבן. היפוקסיה / איסכמיה עם / בלי זיהום מערכתי הם הגורמים העיקריים של PVL. קשירת הראש חד צדדית וחשיפה היפוקסיה עם / בלי זריקה lipopolysaccharide יוצר PVL כמו נגעים בעכברים P6.
Abstract
אנו מתארים פרוטוקול להקמת מודלים העכבר של לויקומלציה periventricular (PVL). PVL היא הצורה הדומיננטית של פגיעה מוחית על פגים לבין מקדימים הנפוץ ביותר של שיתוק מוחין. PVL מתאפיינת נזק periventricular החומר הלבן עם פציעה oligodendroglial בולט. היפוקסיה / איסכמיה עם או ללא זיהום דלקת מערכתית / הם הגורמים העיקריים של PVL. אנו משתמשים בעכברים P6 כדי ליצור מודלים של פגיעה מוחית בילוד ידי אינדוקציה של היפוקסיה / איסכמיה עם או ללא זיהום דלקת מערכתית / עם קשירת הראש החד צדדית ובעקבותיה החשיפה היפוקסיה עם או בלי זריקה של lipopolysaccharide רעלן פנימי (LPS). אימונוהיסטוכימיה של חלבון המיאלין הבסיסי (MBP) או O1 ו בדיקה מיקרוסקופית אלקטרונים להראות אובדן המיאלין בולט החומר הלבן במוח עם נזק נוסף בהיפוקמפוס, התלמוס. הקמת מודלים העכבר של PVL יהיה מאוד להקל על מחקר של הפתוגנזה במחלה באמצעות זמין זנים עכבר מהונדס, הולכה של ניסויים התרופה באופן תפוקה גבוהה יחסית לזהות סוכני מועמד טיפולית, ובדיקה של השתלת תא גזע באמצעות זנים העכבר כשל חיסוני.
Protocol
נהלים מפורטים של יצירת פגיעה מוחית בילוד בעכברים P6:
- אחרי לידה יום 6 (P6) בעכברים מורדמים עם קירור עקיף על הקרח עד כדי חוסר תגובה לגירוי המזיק (הרדמה עמוקה).
- לאחר ניקוי העור עם אלכוהול, חתך קו האמצע הגחון נעשית בצוואר הקדמי.
- תחת מיקרוסקופ לנתח, הסתעפות של עורק התרדמה הימני המשותף הוא פנה retracting בעדינות את השרירים ואת omohyoid sternocleidomastoid.
- Fascia נדן סביב הצוואר מוסר, ואת הסניף פנימי פרוקסימלי מבודד העצב התועה סמוך הגרעינים אוהד עם וו. בעורק התרדמה הפנימי הוא צרוב אז באמצעות צריבה קצה.
- בעקבות צריבה, חתך את העור sutured, ואת חיה נשמר חם עד ער לחלוטין וחזר הסכר.
- שעה אחת לאחר קשירת, החיה ממוקם בתא אטום רווי חנקן עד לרמה של 6.0% O 2 הוא הגיע. החיה נחשפת מכן 35 דקות של חוסר חמצן.
- לאחר החשיפה היפוקסיה, העכבר מתאושש על כרית חימום (33 מעלות) למשך 30 דקות ולאחר מכן הוא חזר הסכר. עבור יצירה של פגיעה מוחית עם היפוקסיה איסכמיה משולב / זיהום / דלקת, החיה מוזרק אז intraperitoneally עם 0.015 מ"ל של lipopolysaccharide (LPS, 1 מ"ג / ק"ג).
- ארבעה ימים post-hypoxia/ischemia, בעכברים מורדמים עם קירור עקיף על הקרח עד כדי חוסר תגובה לגירויים מזיקים, perfused אז עם paraformaldehyde 4% מלח ולאחר מכן. המוח יוסרו cryoprotected.
באיור 1. אפיון של פגיעה מוחית במודל hypoxic / איסכמי את העכבר עם H & E מכתים. יש נמק מוקדי (חיצים) בחומר הלבן המוחי ipsilateral (א) כדי קשירת הראש, בהשוואה משנה הנגדי הלבן מוחין (B). נמק Ipsilateral ו microinfarcts מוקד הם נצפו בהיפוקמפוס (C) התלמוס (ד) במוחם עם פגיעה מוחית משנה ipsilateral לבן.
נציג תוצאות ומספרים:
מודלים של עכבר PVL עם היפוקסיה / איסכמיה ו / או זיהום / דלקת מושגות על ידי קשירת הראש החד צדדית ובעקבותיה החשיפה היפוקסיה ו הזרקה של LPS. אנחנו להגדרת מודלים העכבר החדש כמודלים PVL מתאים. בדיקה Neuropathological סעיפים העטרה מוכתם hematoxylin-and-eosin (H & E) דרך forebrain כולו מגלה נמק מוקדי בחומר הלבן המרכזי של האונה מוחין ipsilateral כדי קשירת הצוואר (איור 1A), עם חוסך יחסית של נוירונים הקורטקס שמעליה מוחין לעומת משנה הנגדי הלבן מוחין (איור 1B). בעניין המוקד הלבן נמקי, יש עלייה ניכרת תאיות המורכב מאקרופאגים האסטרוציטים תגובתי, כמו אופיינית PVL מוקד אנושי. בעניין הנגדי הלבן המרכזי, הגרעינים oligodendroglial מסודרים fascicular כמו צרורות; בארכיטקטורה זו מופרת לחלוטין על ידי נמק המוקד בצד ipsilateral. יש לציין, אנחנו גם רואים נמק ipsilateral בהיפוקמפוס (איור 1C) ו התלמוס (microinfarcts המוקד) (איור 1D) במוחם עם פגיעה מוחית משנה ipsilateral לבן. האדם PVL גם אינו מתרחש בבידוד מוחלט מן המלווה בנגעים החומר האפור. סימן ההיכר של PVL היא יחסית, אם כי לא מוחלטת, חוסך בקליפת המוח שמעל החומר הלבן נפצעו - תכונה שאנו מאמינים כי קיים מודלים העכבר שלנו.
איור 2. סולם ניקוד של 0-5 להערכת פגיעה בחומר הלבן של MBP או O1 בעכברי מודל לויקומלציה periventricular.
מודלים העכבר שלנו להראות מאפיינים של PVL בשני רמות פנוטיפי מולקולרית. השתמשנו immunocytochemical זיהוי של חלבון המיאלין הבסיסי (MBP) או O1-אנטיגן כדי להעריך את הפגיעה, הקימו בקנה מידה סטנדרטי 0-5 להבקיע את הפגיעה בחומר הלבן (איור 2), הגדירו את העניין הפתולוגיה לבן (איור . 3). לאחרונה, assay stereological בלתי משוחד יושמה להחליף את השיטה וכמותיות הראשונית. בנוסף, כדי לבדוק את ההשפעות המצטרף לפגיעה בחומר הלבן על התוצאות פונקציונלי, אנחנו צריכים לבצע בדיקות התנהגותיות התפקוד המוטורי. אנחנו הראו כי עכברים התערוכה גירעונות מנוע פגיעה היפוקסיה P10-21 הבאות / איסכמיה פלוס LPS ב P6. קבענו קריטריונים עם ניקוד בסולם של 0-4 להגדיר תפקוד האיבר הנגדי בעכברים שנפגע P10-21. בדרך כלל, עכברים נורמליים יכולים רצות במעלה המדרון 30 מעלות (ציון 4), לטפס על 45 ° שיפוע ללא הזזה (ציון של 3). עכברים פצועים יש ניקוד נמוך ב קורלציה עם דרגות של פגיעה בחומר הלבן.
איור 3. אפיון של פגיעה בחומר הלבן של MBP או O1 מכתים ומבנה המיאלין על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים (EM). MBP ולהראות O1 מכתים המיאלין אובדן החומר הלבן במוח ipsilateral כדי קשירת, לעומת החומר הלבן הנגדי. בדיקה מראה EM אקסונים myelinated בעניין לבן מוחין הנגדי כדי קשירת ו הידרדר רקמות החומר הלבן ipsilateral.
אנו צופים כי הקמת מודלים העכבר החדש של PVL יאפשר לנו לחקור מנגנונים מסוים של פגיעה PVL כמו למוח בוגר. נתייחס בפתוגנזה באמצעות זנים עכבר מהונדס לבחון את התפקיד של מולקולות בודדות של עניין ולהעריך מטרות neuroprotection.
Discussion
פגיעה במוח המתפתח מוביל לתוצאות הרסניות נוירולוגיות. באופן מפתיע, את דפוס של פגיעה מוחית סביב הלידה הוא מאוד תלויי גיל. אצל תינוקות טווח, זה בעיקר משפיע על קליפת המוח עם איבוד עצבי אופייני. עם זאת, פגים, זה משפיע באופן סלקטיבי החומר הלבן במוח עם פגיעה בולט oligodendrocytes בפיתוח, הפרעה המכונה לויקומלציה periventricular (PVL). עוצמת הבעיה של פגיעה מוחית אצל התינוק בטרם עת הוא יוצא דופן. מסירה מוקדמת ומשופרת לטיפול נמרץ בילוד הובילו כמעט 90% של הישרדות של 13 מיליון פגים ברחבי העולם (כ 56,000 בארצות הברית) נולד שנתי עם משקל לידה מתחת 1500 גרם, כלומר מאוד נמוך משקל לידה ותינוקות. כ -10% מכלל הניצולים לאחר מכן התערוכה שיתוק מוחין כ -50% יש ליקויים קוגניטיביים והתנהגותיים. PVL המוח החשוב ביותר הפתולוגיה שיתוק מוחין הבסיסית פגים. אין טיפול ספציפי עבור PVL כיום קיים, בין השאר משום בפתוגנזה לא הובן היטב 1,2.
למרות האטיולוגיה של PVL היא multifactorial, הלידה היפוקסיה / איסכמיה עם זיהום אימהי תוך רחמי נחשב הגורם העיקרי PVL. מודל hypoxic / איסכמי של PVL בחולדה ב P7 כבר נקבעה בעבר 3. מודל זה הוא ייחודי בכך שהוא דומה PVL ב פגים. סימן ההיכר של הדגם הזה הוא עניין סלקטיבי לבן פתולוגיה, בניגוד למרבית הדגמים שבץ המאופיינים לאוטם החומר האפור. עם זאת, מגבלות המודל hypoxic-איסכמי של החולדה לא צריך להתעלם. ראשית, האטיולוגיה של PVL הוא multifactorial לעיתים קרובות. בנוסף לדלקת היפוקסיה / איסכמיה, אימהית, העובר זיהום / הוא קשור מאוד עם PVL. לפיכך, דלקת היפוקסיה / איסכמיה זיהום / משולב עלול ליצור מודלים נוספים PVL דמוי. הגיל מכרסם בצורה הטובה ביותר בקורלציה עם תקופת ההתפתחות האנושית של הסיכון הגדול ביותר עבור PVL נגעים (24-32 שבועות של הריון) הוא כי לאחר הלידה בידול oligodendroglial הוא בעיקר אירוע הלידה במכרסמים. כפי שאי אפשר לייצר זיהום אימהי, העובר / דלקת הגילאים לאחר הלידה, יהיה זה סביר כדי לדמות זיהום בשלב רלוונטי התפתחותי לאחר הלידה כדי ליצור מודל של מכרסם PVL. יש לנו ניסו לשלב הזרקת LPS עם המודל hypoxic / איסכמי בעכברים ב P6, כדי לייצר נגעים PVL רלוונטית יותר מבחינה קלינית. שנית, גישה אופטימלית הוכחה של קונספט ניסיוני תפקיד סיבתי של מולקולה מחייב את השימוש של העכברים הטרנסגניים, מניפולציות גנטיות הן הרבה יותר בחולדה מאשר העכבר. לכן, יש ביקשו להמיר מודל ניסיוני שלנו PVL מן החולדה על העכבר.
מודלים של עכבר PVL יהיה מאוד להקל 1) את המחקר של הביולוגיה מחלות בפתוגנזה שימוש זמין זנים עכבר מהונדס; 2) הולכה של התרופה בניסויים כדי לגלות סוכנים מועמד עם פוטנציאל טיפולי; 3) בדיקות של כלי בתאי גזע באמצעות זנים עכבר immunodeficient.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו היא חלק נתמך על ידי מענקים מן המכונים הלאומיים לבריאות (RO1 NS059043 ו RO1 ES015988), טרשת נפוצה האגודה הלאומית, רוש קרן מחקר אנמיה, פלדשטיין רפואי הקרן, ו שריינרים חולים לילדים.
ברצוננו להודות תענוג ד"ר דוד הצעות שלו. עבודה זו הייתה חלק נתמך על ידי מענקים ל WD מן המכונים הלאומיים לבריאות (RO1 NS059043 ו RO1 ES015988), החברה הלאומית טרשת נפוצה, ו שריינרים חולים לילדים. אנו מצהירים שום אינטרסים מתחרים הקשורים במאמר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L4130 | |
| Hypoxia Chamber | BioSpherix | A-30274 | |
| Surgical hook | F.S.T. | 10064-14 |
References
- Volpe, J. J. Neurology of newborn. , Saunders. Philadelphia. 217-276 (2001).
- Deng, W., Pleasure, J., Pleasure, D. Progress in periventricular leukomalacia. Arch. Neurol. 65, 1291-1295 (2008).
- Follett, P. L., Deng, W., Dai, W., Talos, D. M., Massillon, L. J., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J., Jensen, F. E. Glutamate receptor-mediated oligodendrocyte toxicity in periventricular leukomalacia: a protective role for topiramate. J. Neurosci. 24, 4412-4420 (2004).
