Summary
כימות של גדיל הדנ"א הכפול פסים באמצעות היווצרות γH2AX כסמן המולקולרית הפכה כלי רב ערך בביולוגיה קרינה. כאן אנו מדגימים את השימוש assay immunofluorescence עבור כימות γH2AX מוקדים לאחר חשיפה לקרינה של תאים.
Abstract
גדיל הדנ"א הכפול הפסקות (DSBs), אשר המושרה על ידי או תהליכים מטבוליים אנדוגני או על ידי מקורות חיצוניים, הם אחד נגעים DNA הקריטי ביותר מבחינת הישרדות ושמירה על שלמות הגנומי. תגובה מוקדמת לזירוז של DSBs הוא זירחון של הגרסה H2A היסטון, H2AX, על שאריות סרין-139, את מוטיב שמור ביותר SQEY בטרמינל C-, להרכיב γH2AX
Protocol
תא הכנה
- קרטינוציטים האדם (FEP-1811) גדלו בינוני keratinocyte-סרום חינם (K-SFM; Invitrogen) בתוספת גורם הגדילה באפידרמיס, תמצית בלוטת יותרת המוח שור ו 20 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין, בשעה 37 ° C ו 5% CO 2.
- ההשעיה תא בודד הוכן על ידי ניתוק עם טריפסין-EDTA (0.05% v / v)
- תאים היו זורעים ב 8-Tek גם מעבדה שקופיות II microchamber (10,000 תאים / טוב) ושקופיות הודגרו במשך 3 ימים ב 37 ° C ו 5% CO 2.
הקרנה
- תאים היו מוקרן על הקרח עם 2 Gy באמצעות מקור 137 Cs (Gammacell 1000 irradiator עלית; Nordion הבינלאומי, קנדה, 20.6 שניות / Gy)
- השליטה Unirradiated ו 2 Gy תאים מוקרן הודגרו במשך שעה 1 ב 37 ° C ו 5% CO 2.
Immunofluorescence מכתים
- מדיה הדליפו את ותאי נשטפו עם 300μl של PBS (w / o Ca 2 + או 2 + Mg) לכל היטב היו מסובבים על מערבל מסלולית במשך 5 דקות.
- המאגר היה מוטה לסירוגין 100μl של 4% המוכן טרי (v / v) paraformaldehyde נוספה גם כל השקופיות הודגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
Incubations כל בוצעו שוקת מכתים humidified - תאים נשטפו אז עם PBS (w / o Ca 2 + או Mg 2 +). שקופיות הונחו בתוך צנצנת Coplin וסובב על מערבל מסלולית במשך 5 דקות. צעד זה לשטוף חזר על עצמו עוד פעמיים.
- המאגר היה היטה את עודף ו PBS בעדינות מחק.
- תאים היו permeabilized באמצעות 100 מ"ל טריטון X-100 (0.1% v / v) לכל היטב הדגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- תאים נשטפו עם PBS (w / o Ca 2 + או Mg 2 +) כמתואר שלבים 3 ו -4 לעיל.
- ללא חלבון מסוים מחייב נסתם 100 מ"ל של BSA (1% v / v) לכל היטב הדגירה 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- BSA עודף היה מוטה לסירוגין 100μl של נוגדנים חד שבטיים העיקרי עכבר היסטון-H2AX אנטי phospho (מדולל 1:500, ב BSA 1%; Millipore), נוספה גם עבור כל הדגירה 1 שעה בטמפרטורת החדר.
- תאים נשטפו עם PBS (w / o Ca 2 + או Mg 2 +) כמתואר שלבים 3 ו -4 לעיל מודגרות עם 100μl של נוגדנים משני (אלקסה פלואוריד 488 עיזים אנטי עכבר IgG מדולל 1:500, ב BSA 1% ; Invitrogen) לכל היטב במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. (נוגדן מדולל הוחזק בחושך לאורך ההליך)
- תאים נשטפו עם PBS (w / o Ca 2 + או Mg 2 +) כמתואר שלבים 3 ו -4 לעיל. עם זאת, החשיפה לאור היה ממוזער שימוש בנייר.
- Counterstaining גרעיני בוצעה עם 100 מ"ל TOPRO3 (מדולל 1:500; Invitrogen) לכל היטב הדגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר
- תאים נשטפו עם PBS (w / o Ca 2 + או Mg 2 +) כמתואר בשלב 10 לעיל.
- חדרי הוסרו בקפידה השקופיות, לחות עודפת נמחק ומחליק הורשו אוויר יבש.
- טיפה אחת של זהב להאריך פתרון אנטי לדעוך (Invitrogen) התווספה לכל היטב שקופיות היו רכוב (22x50 מ"מ coverslip) וכל נוזל עודף מסביב לקצוות של שקופיות נמחק.
- מגלשות הוחזקו בחושך במשך 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר לפני איטום עם לק.
- השקופיות היו מאוחסנים לילה בשעה 4 ° C בחושך לפני ניתוח.
מיקרוסקופית / ניתוח
- Zeiss LSM510 Meta Confocal Microscpe נהג לרכוש תמונות באמצעות תקן ה-GFP (עבור γH2AX - Alexa פלואוריד 488 עיזים אנטי עכבר IgG) ולייזרים אדום רחוק (עבור TOPRO-3). בדרך כלל, 63 x טבילה שמן העדשה משמש מטרה.
תמונות נרכשים דפוס Z-סדרה עם גודל צעד של 0.5 מיקרומטר. גודל הצעד של 0.5 מיקרומטר נבחרה כדי להקטין את איבוד של ההווה מוקדים במטוסים שונים הגרעינים. במהלך הניתוח, מטוסים בודדים deconvoluted וערמה לייצר תמונה מוקרנת מרבי כדי לצמצם את החפיפה של מוקדים (Top-כובע מסנן מוחל). - Metamorph (התקנים מולקולריים, ארה"ב) שימש לנתח מספר מוקדים.
התוכנית quantitates מספר מוקדים בכל תא אחרי סף הוחל לכלול רקע. המידע נרשם גיליון אלקטרוני של Microsoft Excel לניתוח נוסף.
באיור 1. להדמיה immunofluorescence של γH2AX מוקדים (ירוק) ב קרטינוציטים האנושי בתאים שלא טופלו ו מוקרן עם 2 Gy וטופחו שעה נוספת בבית 1 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. ה-DNA היה מוכתם TOPRO-3 (כחול). תמונות נרכשו באמצעות LSM Zeiss 510 מיקרוסקופ Meta Confocal. בר = 10 מיקרומטר.
איור 2. להדמיה immunofluorescence של γH2AX מוקדים (ירוק) ב קרטינוציטים האנושי בתאים מוקרן עם 2 Gy וטופחו שעה נוספת בבית 1 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. תמונות נרכשו באמצעות LSM Zeiss 510 מיקרוסקופ Confocal באמצעות Meta 0.5 מיקרומטר Z-חתך (1-9) כדי להבטיח את כל מוקדי נרכשו. התמונות נערם ואז quantitation באמצעות Metamorph. ה-DNA היה מוכתם TOPRO-3 (כחול). ΓH2AX מוערמים ותמונות כחול נערמו להדמיה. בר = 10 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעקבות חשיפה לקרינה מייננת (קרני ה-γ), γH2AX טופס מוקדים במהירות ומספרי מוקדים להגיע למקסימום בין 30-60 דקות 2. לכן, 1 שלנו שלאחר הקרנת שעה נקודת זמן משקפת הראשונית היווצרות DSB. השתמשנו הקרינה רלוונטיות קלינית של 2 Gy לצורך הניסוי שלנו. עם זאת, השיטה ניתן להשתמש במינון קרינה עד 4 Gy לגילוי של היווצרות DSB הראשונית; חפיפה משמעותית של מוקדים מונע quantitation מדויק במינונים גבוהים. מנות קרינה גבוהה ניתן להשתמש שלאחר הקרנה פעמים יותר הדגירה, כמו γH2AX מוקדים אובדים בשל התיקון, וכתוצאה מכך לכימות מספרי. בדרך כלל, 4 שעה עד שעה 24 שלאחר הקרנה פעמים הדגירה משמשים תיקון דנ"א ניטור. השתמשנו DNA הכתם TOPRO-3 בשל מגבלות של לייזרים עירור של מיקרוסקופ confocal שלנו. בדרך כלל, 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) משמש counterstaining גרעיני. למרות שאנו השתמשו במיקרוסקופ confocal, מיקרוסקופים epifluorescent עם Z-חתך קיבולת מספיקות. השיטה immunofluorescence מתאים סרטן חסיד אחרים שורות תאים נורמליים, יש לנו נבדק T98G גליובלסטומה אדם נורמלי בתאי האנדותל האדם חולדה H9c2 myocytes חדרית עובריים.
לבסוף, quantitation של γH2AX שימושי בהקשר של קרינה מייננת הנגרמת נזק לדנ"א, לכל נזק ניטור ה-DNA כפי שמודגם בניסוי שלנו ולתקן (רגישות לקרינה). Assay שימושית גם להערכת היעילות של תרכובות לווסת תגובות תאית לקרינה (מגיני קרינה כלומר ו לרגישות). יתר על כן, γH2AX מתגלה סמן מולקולרי פוטנציאליים הזדקנות ומחלות, בעיקר סרטן 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
התמיכה של המכון האוסטרלי גרעיני מדע והנדסה הוא הודה. TCK היה זכה בפרסים AINSE. המעבדה לרפואה epigenomic נתמכת הבריאות הלאומי המועצה למחקר רפואי של אוסטרליה (566,559). LM נתמך על ידי מלבורן מחקר (אוניברסיטת מלבורן) ו ביו הדמיה מלגות CRC משלים. התמיכה של מונש Micro Imaging (ד"ר סטיבן קודי ואת היתר קרמייקל) היה שלא יסולא בפז עבור עבודה זו.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM) | Media | Invitrogen | 17005042 | Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE). |
| Lab Tek lI Chamber Slides (8-well) | Chamber Slides | Nalge Nunc international | NUN154534 | |
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Glaser | CS2250100 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA x10 | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | EMD Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | Refractive index of 1.42 at 20°C. |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Biosciences | 353112 | |
| Tissue Culture Dish (150x25mm) | Petridish | BD Biosciences | 353025 | |
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M.
- Savic, V. Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin. Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).
- Downs, J. Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites. Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).
- Chowdhury, D. [gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair. Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).
- Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint. EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).
- Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes. Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).
- Kusch, T. Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions. Science. 306, 2084-2087 (2004).
- Hurlin, P. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).
- Dickey, J. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. , Forthcoming (2009).
