Summary
Количественная оценка ДНК двухцепочечной полосы использованием γH2AX формирование как молекулярный маркер стал бесценным инструментом в области радиационной биологии. Здесь мы демонстрируем использование иммунофлуоресценции для количественного определения γH2AX очагов после контакта клеток к радиации.
Abstract
ДНК двунитевых разрывов (ДР), которые индуцируются или эндогенных процессов обмена веществ или экзогенными источниками, являются одним из самых критических повреждений ДНК в отношении выживания и сохранения целостности генома. Ранний ответ на индукции ДР является фосфорилирование гистонов H2A вариант, H2AX, на серин-139 остатка, в хорошо сохранились и С-концевой мотив SQEY, образуя γH2AX
Protocol
Сотовые подготовка
- Кератиноцитов человека (FEP-1811) были выращены в кератиноцитов-бессывороточной среде (K-УЛП; Invitrogen) с добавлением эпидермального фактора роста, бычий гипофизарный экстракт и 20 мкг / мл гентамицина, при 37 ° С и 5% СО 2.
- Суспензии отдельных клеток, был подготовлен отсоединения трипсином-ЭДТА (0,05% об / об)
- Клетки высевают в 8-и Лаборатории Tek II слайды микрокамере (10000 клеток / лунку) и слайды инкубировали в течение 3 дней при температуре 37 ° C и 5% СО 2.
Облучение
- Клетки облучали на льду с использованием 2 Гр 137 Cs источника (Gammacell 1000 Elite облучателя; Nordion International, ON, Канада; 20,6 секунды / Гр)
- Необлученный контроля и 2 Гр облученных клеток инкубировали в течение 1 часа при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
Иммунофлуоресценции окрашивание
- СМИ была наклонили и клетки промывали 300 мкл ФСБ (без Са 2 + или Mg 2 +) в каждую лунку и были повернуты на орбитальной смесителя в течение 5 минут.
- Буфера наклонили и 100 мкл свежеприготовленного 4% (объем / объем) параформальдегида был добавлен в каждую лунку и слайды инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут.
Все инкубации проводили в увлажненной корыта окрашивание - Затем клетки промывали PBS (без Са 2 + или Mg 2 +). Слайды были помещены в банки Коплин и повернуты на орбитальной смесителя в течение 5 минут. Этот шаг был мыть повторяется еще два раза.
- Буфера наклонили и избыток PBS мягко уничтожены.
- Клетки были проницаемыми использованием 100мл Тритон Х-100 (0,1% об / об) в каждую лунку и 10 минут инкубации при комнатной температуре.
- Клетки промывали PBS (без Са 2 + или Mg 2 +), как описано в шагах 3 и 4 выше.
- Неспецифические связывания с белками был блокирован с 100 мл BSA (1% об / об) на одну скважину и 20 минут инкубации при комнатной температуре.
- Превышение БСА наклонили и 100 мкл первичных мышиных моноклональных анти-фосфо-гистон H2AX антител (разбавленной 1:500, в 1% BSA; Millipore), был добавлен в каждую лунку за 1 час инкубации при комнатной температуре.
- Клетки промывали PBS (без Са 2 + или Mg 2 +), как описано в шагах 3 и 4 выше, и инкубируют с 100 мкл вторичных антител (Alexa Fluor 488 антимышиного IgG разбавленной 1:500, в 1% BSA ; Invitrogen) на скважину в течение 45 минут при комнатной температуре в темноте. (Разводненная антител был в неведении в течение всей процедуры)
- Клетки промывали PBS (без Са 2 + или Mg 2 +), как описано в шагах 3 и 4 выше. Тем не менее, воздействие света было сведено к минимуму использование фольги.
- Ядерная counterstaining была выполнена с 100 мл TOPRO3 (разбавленным 1:500; Invitrogen) на скважину и 10 минут инкубации при комнатной температуре
- Клетки промывали PBS (без Са 2 + или Mg 2 +), как описано в пункте 10 выше.
- Камеры были тщательно удалены из слайдов, избыток влаги уничтожены и слайды было позволено высохнуть на воздухе.
- Одна капля Продли ЗОЛОТО анти-Fade решение (Invitrogen) был добавлен в каждую лунку и слайды были установлены (22x50 мм покровным) и лишнюю жидкость по краям слайд был уничтожены.
- Слайды держали в темноте в течение еще 30 минут при комнатной температуре до уплотнения с лаком для ногтей.
- Слайды, хранились в течение ночи при 4 ° С в темноте перед проведением анализа.
Микроскопия / Анализ
- Zeiss LSM510 Мета конфокальной Microscpe использоваться для получения изображений с помощью стандартного GFP (для γH2AX - Alexa Fluor 488 антимышиного IgG) и дальнего красного лазеров (для TOPRO-3). Как правило, 63 х нефти погружения объектива используется.
Изображения, приобретенных в Z-серии модель с шагом в 0,5 мкм. Размер шага 0,5 мкм была выбрана, чтобы минимизировать потери нынешнего очагов в разных плоскостях, в ядрах. При анализе отдельных плоскостей deconvoluted и сложены для получения максимальной проецируемого изображения, чтобы минимизировать перекрытие очагов (Топ-хэт применения фильтра). - Метаморф (Molecular Devices, США) была использована для анализа числа очагов.
Программа quantitates числа очагов в каждой ячейке после порог был применен для исключения фона. Информация заносится в электронные таблицы Microsoft Excel для дальнейшего анализа.
Рисунок 1. Иммунофлуоресценции визуализации γH2AX очагов (зеленый) в необработанном кератиноциты человека и в клетках, облученных 2 Гр и инкубировали еще в течение 1 часа при температуре 37 ° C, 5% СО 2. ДНК окрашивали TOPRO-3 (синий). Изображения были получены с помощью Zeiss LSM 510 Мета конфокальной микроскопии. Bar = 10 мкм.
Рисунок 2. Иммунофлуоресценции визуализации γH2AX очагов (зеленый) в человеческих кератиноцитов и в клетках, облученных 2 Гр и инкубировали еще в течение 1 часа при температуре 37 ° C, 5% СО 2. Изображения были получены с помощью Zeiss LSM 510 Мета конфокальной микроскопии используют 0,5 мкм Z-срезов (1-9), чтобы убедиться, что все очаги были приобретены. Изображений было потом укладывали для количественного использования Метаморф. ДНК окрашивали TOPRO-3 (синий). Сложены γH2AX и синие изображения были сложены для визуализации. Bar = 10 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
После воздействия ионизирующего излучения (γ-лучи), γH2AX очагов форме быстро и очагов номера достигают максимума между 30-60 минут 2. Таким образом, наша 1 час после облучения момент времени отражает начальное образование DSB. Мы использовали клинически значимые дозы облучения 2 Гр для нашего эксперимента. Тем не менее, метод может быть использован для дозы облучения до 4 Гр для определения начального формирования DSB; значительное перекрытие очагов исключает точное количественное при более высоких дозах. Более высокие дозы излучения могут быть использованы для более послереакторных время инкубации, а γH2AX очаги потеряли из-за ремонта, что приводит к количественному чисел. Как правило, 4 часа и до 24 часа после облучения время инкубации используются для мониторинга ремонт ДНК. Мы использовали ДНК пятна TOPRO-3 из-за ограничений в возбуждении лазерами нашей конфокальной микроскопии. Чаще всего, 4,6-diamidino-2-фенилиндола дигидрохлорид (DAPI) используется для ядерных counterstaining. Хотя мы использовали конфокальной микроскопии, epifluorescent микроскопов с Z-срезов мощности являются адекватными. Иммунофлуоресценции метод подходит для других сторонником рака и нормальных клеточных линий; мы проверили T98G человека глиобластомы и нормальные человеческие эндотелиальные клетки и крысы H9c2 эмбриональных миоцитах желудочков.
Наконец, количественного определения γH2AX полезно в контексте ионизирующего радиационных повреждений ДНК, для контроля повреждений ДНК, как показывает наш эксперимент и ремонту (радиационная чувствительность). Анализ также полезен для оценки эффективности соединений, которые модулируют клеточных реакций на излучение (например, защитники излучения и сенсибилизаторов). Кроме того, γH2AX становится потенциальным молекулярным маркером старения и болезней, преимущественно в раковых 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Поддержке австралийского Института ядерной науки и техники не будет подтверждено. TCK был удостоен AINSE наград. Эпигеномном Лаборатории медицины при поддержке национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (566 559). Л. М. поддерживается Мельбурне исследований (Университет Мельбурна) и биомедицинской визуализации стипендии CRC дополнительных. Поддержка Micro Монаш Imaging (доктора Стивена Коди и ISKA Кармайкл) был бесценен для этой работы.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM) | Media | Invitrogen | 17005042 | Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE). |
| Lab Tek lI Chamber Slides (8-well) | Chamber Slides | Nalge Nunc international | NUN154534 | |
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Glaser | CS2250100 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA x10 | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | EMD Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | Refractive index of 1.42 at 20°C. |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Biosciences | 353112 | |
| Tissue Culture Dish (150x25mm) | Petridish | BD Biosciences | 353025 | |
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M.
- Savic, V. Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin. Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).
- Downs, J. Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites. Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).
- Chowdhury, D. [gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair. Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).
- Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint. EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).
- Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes. Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).
- Kusch, T. Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions. Science. 306, 2084-2087 (2004).
- Hurlin, P. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).
- Dickey, J. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. , Forthcoming (2009).
