Summary
Kwantificering van DNA dubbel-strengs strepen met behulp van γH2AX vorming als een moleculaire marker is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in straling biologie. Hier laten we zien het gebruik van een immunofluorescentie assay voor de kwantificering van γH2AX foci na blootstelling van cellen aan straling.
Abstract
DNA dubbel-breuken (DSB's), die worden veroorzaakt door een endogene metabole processen of door exogene bronnen, zijn een van de meest kritische DNA-laesies met betrekking tot de overleving en behoud van de genomische integriteit. Een vroege reactie op de inductie van DSB is fosforylatie van het H2A histon-variant, H2AX, op de serine-139 residu, in de zeer geconserveerd C-terminale SQEY motief, de vorming van γH2AX
Protocol
Celpreparaat
- Humane keratinocyten (FEP-1811) werden gekweekt in keratinocyten-serum vrij medium (K-SFM; Invitrogen), aangevuld met epidermale groeifactor, runder-hypofyse-extract en 20 ug / ml gentamycine, bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Een enkele celsuspensie werd bereid door het losmaken met trypsine-EDTA (0,05% v / v)
- Cellen werden gezaaid in 8-goed Lab Tek II microchamber dia's (10.000 cellen / putje) en dia's werden gedurende 3 dagen bij 37 ° C en 5% CO 2.
Bestraling
- Cellen werden bestraald op ijs met 2 Gy met behulp van een 137 Cs bron (Gammacell 1000 Elite bestraler, Nordion International, ON, Canada, 20,6 seconden / Gy)
- Bestraald controle en 2 Gy bestraalde cellen werden geïncubeerd gedurende 1 uur bij 37 ° C en 5% CO 2.
Immunofluorescentiekleuring
- Media werd getipt en cellen werden gewassen met 300μl van PBS (w / o Ca 2 + of Mg 2 +) per well en werden gedraaid op een orbitale mixer gedurende 5 minuten.
- De buffer werd getipt en 100μl van vers bereide 4% (v / v) paraformaldehyde werd aan elk putje toegevoegd en dia's werden geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
Alle incubaties werden uitgevoerd in een vochtige vlekken trog - Cellen werden vervolgens gewassen met PBS (w / o Ca 2 + of Mg 2 +). Dia's werden geplaatst in een Coplin pot en gedraaid op een orbitale mixer gedurende 5 minuten. Deze wasstap werd herhaald met nog eens twee keer.
- De buffer werd getipt en overtollige PBS werd voorzichtig uitgewist.
- Cellen werden gepermeabiliseerde met behulp van 100ml Triton X-100 (0,1% v / v) per well en een 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur.
- De cellen werden gewassen met PBS (w / o Ca 2 + of Mg 2 +), zoals beschreven in stappen 3 en 4 hierboven.
- Niet-specifieke eiwit binding werd geblokkeerd met 100 ml van de BSA (1% v / v) per well en 20 minuten incubatie bij kamertemperatuur.
- Excess BSA was getipt en 100μl van primaire muizen monoklonale anti-fosfo histon-H2AX antilichaam (1:500 verdund in 1% BSA, Millipore), werd aan elk putje toegevoegd voor een een uur incubatie bij kamertemperatuur.
- De cellen werden gewassen met PBS (w / o Ca 2 + of Mg 2 +), zoals beschreven in stappen 3 en 4 hierboven en geïncubeerd met 100μl van secundaire antilichaam (Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG verdund 1:500, in 1% BSA ; Invitrogen) per goed voor 45 minuten bij kamertemperatuur in het donker. (Verwaterd antilichaam werd in het donker bewaard gedurende de procedure)
- De cellen werden gewassen met PBS (w / o Ca 2 + of Mg 2 +), zoals beschreven in stappen 3 en 4 hierboven. Echter, was de blootstelling aan het licht geminimaliseerd via folie.
- Nucleaire tegenkleuring werd uitgevoerd met 100 ml TOPRO3 (verdund 1:500, Invitrogen) per goed en een 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur
- De cellen werden gewassen met PBS (w / o Ca 2 + of Mg 2 +), zoals beschreven in stap 10 hierboven.
- De kamers werden zorgvuldig verwijderd uit de dia's, werd overtollig vocht uitgewist en dia's mochten aan de lucht drogen.
- Een druppel ProLong GOLD anti-fade-oplossing (Invitrogen) werd per well toegevoegd en dia's werden gemonteerd (22x50 mm dekglaasje) en de overtollige vloeistof rond de randen van de glijbaan was weggevaagd.
- De dia's werden bewaard in het donker nog eens 30 minuten bij kamertemperatuur alvorens afdichten met nagellak.
- De dia's werden gedurende de nacht bewaard bij 4 ° C in het donker voor de analyse.
Microscopie / Analyse
- Zeiss LSM510 Meta Confocale Microscpe gebruikt om beelden met behulp van de standaard GFP te verwerven (voor γH2AX - Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG) en ver rode lasers (voor TOPRO-3). Meestal wordt een 63 x olie-immersie objectief gebruikt.
Beelden worden verworven in een Z-serie patroon met een stapgrootte van 0,5 micrometer. Een stapgrootte van 0,5 um werd gekozen om het verlies van foci aanwezig te minimaliseren in verschillende vlakken in de kernen. Tijdens de analyse worden individuele vliegtuigen deconvoluted en gestapeld tot een maximum geprojecteerde beeld om de overlap van foci (Top-hat filter toegepast) te minimaliseren produceren. - Metamorph (Molecular Devices, USA) werd gebruikt om het aantal foci te analyseren.
Het programma quantitates het aantal haarden in elke cel nadat de drempel is toegepast op de achtergrond uit te sluiten. De informatie wordt geregistreerd in een Microsoft Excel spreadsheet voor verdere analyse.
Figuur 1. Immunofluorescentie visualisatie van γH2AX foci (groen) in onbehandeld humane keratinocyten en in cellen bestraald met 2 Gy en geïncubeerd gedurende nog eens 1 uur bij 37 ° C, 5% CO 2. DNA werd gekleurd met TOPRO-3 (blauw). Beelden werden verkregen met behulp van een Zeiss LSM 510 Meta confocale microscoop. Bar = 10 urn.
Figuur 2. Immunofluorescentie visualisatie van γH2AX foci (groen) in de menselijke keratinocyten en in cellen bestraald met 2 Gy en geïncubeerd gedurende nog eens 1 uur bij 37 ° C, 5% CO 2. Beelden werden verkregen met behulp van een Zeiss LSM 510 Meta Confocale microscoop met behulp van 0,5 micrometer Z-snijden (1-9) om te zorgen dat alle foci werden verworven. De beelden is vervolgens gestapeld voor kwantificering met behulp van Metamorph. DNA werd gekleurd met TOPRO-3 (blauw). De gestapelde γH2AX en blauwe beelden werden gestapeld voor visualisatie. Bar = 10 urn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Na blootstelling aan ioniserende straling (γ-stralen), γH2AX foci vorm snel en foci nummers oplopen tot tussen de 30-60 minuten 2. Daarom is onze 1 uur na de bestraling tijdstip weerspiegelt de initiële vorming van DSB. Wij hebben gebruik gemaakt van de klinisch relevante stralingsdosis van 2 Gy voor ons experiment. Toch kan de methode worden gebruikt voor straling doses tot 4 Gy voor de detectie van de eerste DSB formatie; belangrijke overlapping van foci sluit accurate kwantificering bij hogere doseringen. Hogere doses straling kan worden gebruikt voor een langere post-bestraling incubatie tijden, zoals γH2AX foci zijn verloren als gevolg van reparatie, wat resulteert in meetbare cijfers. Meestal worden vier uur en maximaal 24 uur na de bestraling incubatietijden gebruikt voor het monitoren DNA-herstel. We hebben de DNA vlek TOPRO-3 als gevolg van beperkingen in de excitatie lasers van onze confocale microscoop. Vaker is het 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) die worden gebruikt voor nucleaire tegenkleuring. Hoewel we gebruik gemaakt van een confocale microscoop, epifluorescerende microscopen met z-snijden capaciteit toereikend zijn. De immunofluorescentie methode is geschikt voor andere aanhanger kanker en normale cellijnen, we hebben getest T98G menselijke glioblastoom en normale menselijke endotheelcellen en ratten H9c2 embryonale ventriculaire myocyten.
Tot slot, kwantificatie van γH2AX is nuttig in de context van ioniserende straling-geïnduceerde DNA-schade, voor controle DNA-schade als geïllustreerd door ons experiment en reparatie (straling gevoeligheid). De test is ook nuttig voor het evalueren van de werkzaamheid van de verbindingen die cellulaire respons op straling (dwz straling beschermers en sensibiliserende) moduleren. Verder is γH2AX naar voren als een potentiële moleculaire marker in veroudering en ziekte, voornamelijk bij kanker 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De steun van het Australian Institute of Nuclear Science and Engineering wordt erkend. TCK was de ontvanger van AINSE awards. Epigenomisch Medicine Lab wordt ondersteund door de National Health en Medical Research Council van Australië (566.559). LM wordt ondersteund door Melbourne Research (Universiteit van Melbourne) en Biomedical Imaging CRC aanvullende beurzen. De ondersteuning van Monash Micro Imaging (Drs Stephen Cody en Iska Carmichael) was van onschatbare waarde voor dit werk.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM) | Media | Invitrogen | 17005042 | Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE). |
| Lab Tek lI Chamber Slides (8-well) | Chamber Slides | Nalge Nunc international | NUN154534 | |
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Glaser | CS2250100 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA x10 | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | EMD Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | Refractive index of 1.42 at 20°C. |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Biosciences | 353112 | |
| Tissue Culture Dish (150x25mm) | Petridish | BD Biosciences | 353025 | |
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M.
- Savic, V. Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin. Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).
- Downs, J. Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites. Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).
- Chowdhury, D. [gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair. Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).
- Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint. EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).
- Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes. Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).
- Kusch, T. Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions. Science. 306, 2084-2087 (2004).
- Hurlin, P. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).
- Dickey, J. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. , Forthcoming (2009).
