Summary
Bir moleküler marker olarak γH2AX oluşumu kullanarak DNA çift iplikli çizgiler Niceleme radyasyon biyoloji paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada hücreler radyasyona maruz kaldıktan sonra γH2AX odakları ölçümü için immünofloresan testinin kullanımını göstermek.
Abstract
Endojen metabolik süreçleri ya da ya da dışsal kaynaklar tarafından indüklenen DNA çift iplikli sonları (DSBs), hayatta kalma ve genomik bütünlüğünün korunması açısından en kritik DNA lezyonlar vardır. DSBs indüksiyon erken bir cevap γH2AX oluşturan, son derece korunmuş C-terminal SQEY motifi, serin-139 kalıntı H2A histon varyant, H2AX fosforilasyon.
Protocol
Hücre Hazırlık
- 37, epidermal büyüme faktörü, sığır hipofiz ekstresi ve 20 mg / ml gentamisin ile desteklenmiş ° C ve% 5 CO 2; İnsan keratinositler (FEP-1811) (Invitrogen K-SFM) keratinosit Serum Ücretsiz Orta yetiştirildiği.
- Tripsin-EDTA (0.05% v / v) ile ayırarak, tek bir hücre süspansiyonu hazırlanmıştır
- Hücreler 8-iyi Lab Tek II microchamber slaytlar ekilirler (10.000 hücrelerinin / iyi) ve slaytlar, 37 ° C'de ve% 5 CO 2 3 gün inkübe edildi .
Işınlama
- Hücreler 137 Cs kaynak (Nordion Uluslararası, ON, Kanada; 20.6 saniye / Gy Gammacell 1000 Elite ışınlama) kullanarak 2 Gy ile buz üzerinde ışınlanmış
- Işınlanmamış kontrolü ve 2 Gy ışınlanmış hücreleri 37 ° C ve% 5 CO 2 'de 1 saat inkübe edildi.
Immünofloresan boyaması
- Medya kapalı uçlu ve hücreler başına 300μl PBS (w / o Ca 2 + veya Mg 2 +) ile yıkanmış ve 5 dakika boyunca bir orbital karıştırıcı döndürüldü.
- Tampon kapalı uçlu ve paraformaldehid her bir kuyunun eklendi ve slaytlar için oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildi taze hazırlanmış% 4 (v / v) 100μl oldu.
Tüm inkubasyon nemlendirilmiş bir boyama çukur yapıldı - Hücreler daha sonra PBS (w / o Ca 2 + ve Mg 2 +) ile yıkandı. 5 dakika için bir yörünge karıştırıcı bir Coplin kavanoz ve döndürülebilir Slaytlar yerleştirildi. Bu yıkama adımı iki kere daha tekrarlandı.
- Tampon kapalı uçlu ve aşırı PBS hafifçe lekelenen.
- Hücreler 100ml Triton X-100 (0.1% v / v) başına ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyon kullanarak permeabilize.
- Hücreler PBS ile yıkandı (w / o Ca 2 + ve Mg 2 +) adım 3 ve 4 yukarıda açıklandığı gibi.
- Non-spesifik protein bağlanma, oda sıcaklığında ve 20 dakika inkübasyon başına 100 ml (% 1 v / v) BSA ile bloke edildi.
- Aşırı BSA kapalı uçlu ve 100μl Birincil fare monoklonal anti-fosfor-H2AX histon antikor (% 1 BSA, 1:500 sulandırılmış; Millipore), oda sıcaklığında 1 saat inkübasyon için her kuyuya eklendi.
- Hücreler PBS ile yıkandı (w / o Ca 2 + veya Mg 2 +), 3 ve 4 yukarıdaki adımları açıklanan ve ikincil antikor 100μl (Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG ile inkübe% 1 BSA, 1:500 seyreltilmiş ; Invitrogen) karanlıkta, oda sıcaklığında 45 dakika boyunca iyi ortalama. (Antikor Seyreltilmiş prosedür boyunca karanlıkta tutulmuştur)
- Hücreler PBS ile yıkandı (w / o Ca 2 + ve Mg 2 +) adım 3 ve 4 yukarıda açıklandığı gibi. Ancak, ışığa maruz folyo kullanılarak en aza indirildi.
- De ortalama ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyon, Nükleer counterstaining 100ml TOPRO3 (Invitrogen 1:500 seyreltilmiş) ile yapıldı
- Hücreler PBS (w / o Ca 2 + ve Mg 2 +) ile yıkandı 10 yukarıda adımda açıklandığı gibi.
- Odaları dikkatle slaytlar çıkarıldı, aşırı nem, lekelenen ve slaytlar kuru hava için izin verildi.
- ALTIN anti-fade çözüm (Invitrogen) uzatmak Bir damla başına eklendi ve slaytlar monte edildi (22x50 mm lamel) ve slayt kenarlarında herhangi bir aşırı sıvı lekelenen oldu.
- Slaytları oje ile sızdırmazlık önce oda sıcaklığında bir 30 dakika daha karanlıkta tutulmuştur.
- Slaytlar gecede 4 saklandı ° C analizden önce karanlıkta.
Mikroskopi / Analiz
- (- Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG γH2AX) ve (TOPRO 3) uzak kırmızı lazerler Zeiss LSM510 Meta Konfokal Microscpe standart GFP kullanarak görüntü elde etmek için kullanılır. Tipik olarak, 63 x immersiyon yağı objektif lens kullanılır.
Görüntüler bir adım boyutu 0,5 mikron ile Z-serisi bir desen elde edilir. Çekirdekleri farklı düzlemlerde odakları mevcut kaybını en aza indirmek için bir adım boyutu 0,5 mikron seçildi. Analizi sırasında, bireysel uçakları deconvoluted ve odakları örtüşme (Top-şapka filtre uygulanan) en aza indirmek için azami Yansıtılan görüntüyü üretmek için yığılmış. - Metamorph (Moleküler Cihazlar, ABD) odaklarının sayısı analiz etmek için kullanılır oldu.
Bu program arka plan dışlamak için eşik uygulandıktan sonra, her hücrede odaklarının sayısı quantitates. Bilgi, daha fazla analiz için bir Microsoft Excel kaydedilir.
Şekil 1 γH2AX odakları (yeşil), tedavi edilmezse insan keratinositler ve 2 Gy ile ışınlanmış ve 37 1 saat daha inkübe hücrelerinde İmmünofloresan görselleştirme ° C,% 5 CO 2 . DNA TOPRO-3 (mavi) ile boyandı. Görüntüler Zeiss LSM 510 Meta Konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi. Bar = 10 mm.
Şekil 2, insan keratinositler ve 2 Gy ile ışınlanmış ve 37 1 saat daha inkübe hücrelerinde γH2AX odakları (yeşil) İmmünofloresan görselleştirme ° C,% 5 CO 2 . Görüntüler tüm odakları satın sağlamak için 0,5 mm Z-kesit (1-9) kullanarak Zeiss LSM 510 Meta Konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi. Görüntüler daha sonra Metamorph kullanarak kantitatif için yığılmış. DNA TOPRO-3 (mavi) ile boyandı. Yığılmış γH2AX ve mavi görüntüleri görünüm için yığılmış. Bar = 10 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
(Γ-ışınları) iyonize radyasyon, hızla γH2AX odakları formu ve odaklar numaraları için aşağıdaki maruziyet 30-60 dakika 2 ila maksimum ulaşır. Bu nedenle, 1 saat ışınlama sonrası bir zaman noktasında ilk DSB oluşumunu yansıtmaktadır. Biz deneyimiz için klinik olarak anlamlı bir radyasyon dozu 2 Gy kullandık. Ancak, yöntem ilk DSB oluşumu tespiti için 4 Gy radyasyon dozları için kullanılır; odakları önemli bir örtüşme yüksek dozlarda doğru kantitatif engellemektedir. ΓH2AX odakları ölçülebilir numaraları, onarım nedeniyle kaybolur gibi yüksek radyasyon dozları, uzun bir post-ışınlama inkübasyon sürelerinde için kullanılan olabilir. Tipik olarak, 4 saat ve 24 saat sonrası ışınlama inkübasyon sürelerinde DNA onarım izlenmesi için kullanılır. Biz DNA bizim konfokal mikroskop uyarma lazerler sınırlamalardan TOPRO-3 dolayı leke var. Daha yaygın olarak, 4,6-diamidino-2-phenylindole dihidroklorür (DAPI) nükleer counterstaining için kullanılır. Konfokal mikroskop ile epifluorescent mikroskopları kullanılır olmasına rağmen z-kesit kapasitesi yeterli. Immünofloresan yöntemi diğer yapışık kanser ve normal hücre hatları için uygundur; insan glioblastoma ve normal insan endotel hücreleri ve sıçan H9c2 embriyonik ventriküler miyositler T98G test ettik.
Son olarak, kantitatif γH2AX, deney ve onarım (radyasyon hassasiyet) tarafından gösterildiği gibi izleme DNA hasarı, radyasyona bağlı DNA hasarını iyonize bağlamında yararlı olur. Tahlil radyasyon (yani radyasyon koruyucuları ve duyarlaştırıcılar) hücresel yanıtları modüle bileşiklerinin etkinliğini değerlendirmek için de yararlıdır. Ayrıca, kanser 10 γH2AX ağırlıklı olarak potansiyel bir moleküler marker olarak yaşlanma ve hastalık ortaya çıkmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Avustralya Nükleer Bilimi ve Mühendisliği Enstitüsü destek kabul edilmektedir. TCK AINSE ödül layık görüldü. Epigenomic Tıp Laboratuarı, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (566.559) Avustralya tarafından desteklenmektedir. LM Melbourne Araştırma (University of Melbourne) ve Biyomedikal Görüntüleme CRC ek burs tarafından desteklenmektedir. Monash Micro Görüntüleme desteği (Dr Stephen Cody ve Iska Carmichael), bu iş için çok değerli idi.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM) | Media | Invitrogen | 17005042 | Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE). |
| Lab Tek lI Chamber Slides (8-well) | Chamber Slides | Nalge Nunc international | NUN154534 | |
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Glaser | CS2250100 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA x10 | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | EMD Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | Refractive index of 1.42 at 20°C. |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Biosciences | 353112 | |
| Tissue Culture Dish (150x25mm) | Petridish | BD Biosciences | 353025 | |
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M.
- Savic, V. Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin. Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).
- Downs, J. Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites. Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).
- Chowdhury, D. [gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair. Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).
- Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint. EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).
- Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes. Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).
- Kusch, T. Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions. Science. 306, 2084-2087 (2004).
- Hurlin, P. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).
- Dickey, J. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. , Forthcoming (2009).
