Summary
हम oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं (OPCs) में भेदभाव के लिए माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं के एक छोटे अणु आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन. यह प्रोटोकॉल उच्च दक्षता के साथ भेदभाव के 30 दिनों के द्वारा Olig2 NG2 + + OPCs उत्पन्न करता है. हम भी एक विधि का वर्णन "spiking" OPCs है कि कार्रवाई क्षमता आग कर सकते हैं उत्पन्न.
Abstract
Oligodendrocytes केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के myelinating कोशिकाओं हैं. Demyelinating रोगों में पुनर्योजी सेल थेरेपी के लिए, वहाँ वंश प्रतिबद्ध प्रत्यारोपण के लिए oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं (OPCs) की एक शुद्ध जनसंख्या पाने में महत्वपूर्ण हित है. OPCs प्रतिलेखन कारक Olig2 और एक proteoglycan NG2 की सतह अभिव्यक्ति की गतिविधि द्वारा विशेषता हैं. GFP-Olig2 (जी Olig2) माउस भ्रूणीय स्टेम (mESC) सेल संवाददाता लाइन का उपयोग करना, हम GFP Olig2 + + NG2 + OPCs में mESCs की भिन्नता के लिए शर्तों को अनुकूलित. हमारे प्रोटोकॉल में, हम पहले mESCs से embryoid निकायों की पीढ़ी (ईबीएस) का वर्णन है. दूसरा, हम छोटे अणुओं के साथ mESC व्युत्पन्न ईबीएस के उपचार का वर्णन: (1) retinoic एसिड (आर ए) और (2) एक ध्वनि हाथी (श्श्श) परिभाषित संस्कृति की शर्तों के तहत agonist purmorphamine (पुर) oligodendroglial वंश में EB भेदभाव निर्देशित करने के लिए. इस दृष्टिकोण से, OPCs 30 दिन की समय अवधि में उच्च दक्षता (> 80%) के साथ प्राप्त किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में mESCs से निकाली गई कोशिकाओं phenotypically प्राथमिक टिशू कल्चर से व्युत्पन्न OPCs के समान हैं. mESC - व्युत्पन्न OPCs spiking बगल में मस्तिष्क OPCs के एक subpopulation के लिए वर्णित संपत्ति नहीं दिखाते. इस electrophysiological संपत्ति का अध्ययन करने के लिए, हम ectopically ना व्यक्त mESC व्युत्पन्न OPCs spiking की पीढ़ी का वर्णन
Protocol
GFP-Olig2 माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (mESCs) से oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं (OPCs) पैदा करने की विस्तृत प्रक्रिया:
- माउस ES सेल लाइन GFP Olig2 (जी Olig2), अमेरिकन प्रकार संस्कृति संग्रह (ATCC) से खरीदा है. mESCs नियमित हर 3 दिन passaged एक विकिरणित माउस भ्रूण fibroblast (MEF) फीडर परत पर. MEF कोशिकाओं 0.1 जिलेटिन लेपित छह अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति कम से कम एक दिन पहले ESCs passaging प्लेट% में चढ़ाया जाता है. mESC संस्कृति माध्यम है Dulbecco संशोधित है ईगल (DMEM) मध्यम (GIBCO) 20% भ्रूण गोजातीय (GIBCO) सीरम, 2 मिमी एल - glutamine, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 0.1 मिमी / β-mercaptoethanol, 1% nonessential अमीनो एसिड के साथ पूरक है ( NEAA), और हज़ार यू / मिलीलीटर लेकिमिया निरोधात्मक कारक.
- एमईएस कालोनियों (TrypLE, 5 मिनट, 37 ° C) एकल कक्षों में trypsinized हैं और पीटा सीरम प्रतिस्थापन मध्यम (KSR) में निलंबित कर दिया, तो कोशिकाओं को एक सेल में एक costar अल्ट्रा कम छह अच्छी तरह से थाली (Corning) अनुलग्नक स्थानांतरित कर रहे हैं 50,000 कोशिकाओं / 2 सेमी की घनत्व. इन परिस्थितियों में, mESCs embryoid निकायों (ईबीएस) के रूप में. KSR मध्यम की न्यूनतम आवश्यक (सदस्य) मध्यम 20% KSR, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 1% NEAA, और 0.1 मिमी / β-mercaptoethanol के साथ पूरक होते हैं.
- 4 दिन से 7 दिन, retinoic एसिड (आरए, 0.2 एम) और purmorphamine (पुर, एम 1) शामिल हैं के रूप में छवि में दिखाया गया है. KSR या N2 मध्यम में 1 ए. N2 मध्यम 1X N2 पूरक, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 1% NEAA, और 0.1 मिमी / β-mercaptoethanol युक्त - सदस्य है. मध्यम हर रोज बदल रहा है.
- 8 दिन, ईबीएस 0.01% polyornithine लेपित बर्तन पर OPC मध्यम है कि N2 मध्यम और fibroblast होते में TrypLE (5min, 37 ° C) और मढ़वाया का उपयोग disaggregated रहे हैं कारक 2 विकास (FGF-2, 20 एनजी / एमएल). मध्यम हर दो दिन बदल जाता है.
- कोशिकाओं (TrypLE, 3 मिनट, 37 ° C) trypsinized कर रहे हैं और लगभग हर हफ्ते replated जब वे मिला हुआ हो. 30 दिन में, कोशिकाओं के 80 से अधिक% GFP/Olig2 अभिव्यक्ति दिखाने के और NG2 पॉजिटिव OPCs की विशेषता हैं.
- Spiking OPCs उत्पन्न करने के लिए, BacMam ना + चैनल किट इन mESC व्युत्पन्न OPCs में ना ध् 1.2 सबयूनिट परिचय करने के लिए प्रयोग किया जाता है. BacMam अभिकर्मक पीबीएस (1 मिलीग्राम घटक ए) के साथ 5 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए मिलाया जाता है. फिर, मिश्रित BacMam अभिकर्मक mESC व्युत्पन्न OPCs संस्कृति में एक 60 मिमी संस्कृति डिश में जोड़ा जाता है (50-70% संगम पर) पहले PBS के साथ rinsing करने के लिए. 2 घंटा ऊष्मायन के बाद, मिश्रित BacMam अभिकर्मक हटा दिया है और OPC के माध्यम 1X बढ़ाने के साथ पूरक के साथ बदल दिया. बढ़ाने घटक बी DMSO (घटक सी) में पुनर्गठन है. अगला, अतिरिक्त 2 घंटा ऊष्मायन के बाद बढ़ाने के साथ मध्यम हटाया है और पूरा OPC मध्यम के साथ प्रतिस्थापित. कोशिकाओं को 24 बजे के बाद assayed हैं.
प्रतिनिधि परिणाम:
भेदभाव छवि में दिखाया प्रोटोकॉल के बाद. MESCs 1A, जी Olig2 शुरू KSR मध्यम और 4 दिनों के लिए निलंबित कर दिया गया embryoid निकायों (ईबीएस) (छवि 1B) के रूप में. फिर, हम sequentially आरए और पुर के साथ ईबीएस इलाज. ईबीएस किसी भी GFP प्रतिदीप्ति 4 दिवस पर नहीं दिखा था और D8 (छवि 1B) पर मजबूत GFP प्रतिदीप्ति. इस समय बिंदु पर, ईबीएस trypsinized थे और N2 वृद्धि FGF 2 कारकों के साथ पूरक मध्यम में मढ़वाया. 22 दिन (D30) के लिए आगे की संस्कृति के बाद, GFP + सेल का प्रतिशत 80.3 पर पहुंच गया ± हमारे प्रवाह cytometry परिणामों के अनुसार 0.6%. के रूप में छवि में दिखाया गया है. 1C, GFP + कोशिकाओं लगातार NG2 धुंधला (96.4 ± GFP सकारात्मक कोशिकाओं के 1.3% थे NG2 सकारात्मक, और 94.8 ± NG2 सकारात्मक कोशिकाओं के 1.5% GFP सकारात्मक थे) के साथ छा. इस प्रकार, इन कोशिकाओं को व्यक्त GFP/Olig2 और NG2, उन्हें OPCs के रूप में परिभाषित.
mESC व्युत्पन्न OPCs (76 कोशिकाओं) विध्रुवण (छवि 2A) पर कार्रवाई क्षमता आग में विफल रहा है. ना ध् 1.2 सबयूनिट ले baculovirus के साथ transducing के बाद, इन mESC व्युत्पन्न OPCs की (94.1% 17 कोशिकाओं के 16) spiking (छवि 2B) के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है.
चित्रा 1. GOlig - mESC के OPCs में भेदभाव (ए) के प्रोटोकॉल embryoid शरीर दिखा योजना (EB) आधारित और छोटे अणु संचालित भेदभाव. D8 में, ईबीएस disaggregated और मढ़वाया थे. कोशिकाओं को एक बार प्रति सप्ताह passaged थे, जब वे मिला हुआ बन गए. (बी) D8, लेकिन D4 ईबीएस नहीं, GFP अभिव्यक्ति से पता चला है. (सी) NG2 (लाल) के Immunostaining GFP D30 (हरा) पर अभिव्यक्ति के साथ संगत था. DAPI (नीला) नाभिक की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया था. स्केल पट्टी: 20 मिमी.
चित्रा 2. जनरेशन वायरस spiking OPCs के द्वारा mESC व्युत्पन्न OPCs nonspiking से मध्यस्थता ना ध् चैनल अभिव्यक्ति (ए) झिल्ली संभावित -60 एम वी और mESC - व्युत्पन्न OPCs में आयोजित किया गया था करने के लिए कार्रवाई क्षमता आग में विफल रहा है, जब भी सेल करने के लिए 0 depolarized था mV. (बी) mESC व्युत्पन्न OPC के एक उदाहरणफायरिंग वायरल पारगमन के बाद संभावित कार्रवाई (लाल रंग में हाइलाइट).
Discussion
भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (ESCs), एक ब्लास्टोसिस्ट भ्रूण से अलग, जीव 3, 4 के सभी कक्ष प्रजातियों में अंतर, जल्दी स्तनधारी विकास का अध्ययन oligodendrocyte विनिर्देशन सहित के लिए इन विट्रो मॉडल प्रणाली में एक प्रदान कर सकते हैं. mESCs ध्वनि (श्श्श) हाथी 5 के उपचार के साथ oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं (OPCs) में अंतर दिखाया गया है . इसके अलावा, श्श्श प्रेरित mESCs से OPC भेदभाव भ्रूण 6 विकास में मनाया सही समय बरकरार रखती है. इसलिए, इन विट्रो mESCs से OPC भेदभाव में की प्रकृति vivo विकास में से क्या सीखा है के साथ संगत होना करने के लिए माना जाता है. यहाँ, छोटे अणुओं आरए और श्श्श agonist पुर का उपयोग, हम सफलतापूर्वक GFP Olig2 + + NG2 + उच्च दक्षता के साथ OPCs में जी Olig2 mESCs विभेदित.
OPCs, NG2 proteoglycan 7 की अभिव्यक्ति और हेलिक्स पाश - हेलिक्स प्रतिलेखन 8 Olig2 कारक द्वारा विशेषता है, विकासशील और परिपक्व सीएनएस में oligodendrocytes उत्पन्न है, जहां वे कुल कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण प्रतिशत (~ 5%) शामिल हैं और मुख्य proliferating सेल प्रकार 9. लगभग दो दशकों शोधकर्ताओं के लिए वी चैनलों ना प्रदर्शन OPCs के एक subpopulation में व्यक्त कर रहे हैं और विध्रुवण 10, 11 पर सक्रिय किया जा सकता है है. इसके अलावा, हाल ही में एक हड़ताली 9 अवलोकन किया गया था कि सफेद मामले में सीटू चूहे सीएनएस में (~ 50%) OPCs कार्रवाई क्षमता उत्पन्न depolarized जब वोल्टेज gated सोडियम (ना वी) चैनलों की अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है और इस तरह spiking में subdivided किया जा सकता है और nonspiking subpopulations. हालांकि, इन गुणों का spiking कार्य अभी भी काफी हद तक अनजान हैं. हमने पाया है कि, electrophysiologically, mESC व्युत्पन्न श्श्श निर्भर प्रोटोकॉल के साथ भेदभाव OPCs, सीटू मस्तिष्क OPCs में के रूप में एक ही नहीं थे. सबयूनिट ना वी 1.2 शुरू करने के बाद, इन मूक mESC व्युत्पन्न OPCs spiking के लिए सक्षम थे .
इस प्रकार, spiking / mESC व्युत्पन्न OPCs और भेदभाव प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित nonspiking (1) spiking और nonspiking OPCs के बीच कार्यात्मक मतभेद, (2) स्क्रीनिंग नए कारक है कि mESC व्युत्पन्न OPCs में सोडियम चैनल अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने के सकता है अध्ययन सुविधा हो सकती है ( 3) के विकास और मानव ईएससी या प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) से OPCs के भेदभाव प्रोटोकॉल अनुकूलन.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के हिस्से में राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NS059043 RO1 और ES015988 RO1), राष्ट्रीय मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसायटी, एनीमिया, अनुसंधान Feldstein मेडिकल फाउंडेशन के लिए रॉश फाउंडेशन, और बच्चों के लिए Shriners अस्पताल से WD अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
हम सुझाव के लिए डॉ. डेविड खुशी और जेनिफर विमान धन्यवाद देना चाहूंगा. हम इस लेख से संबंधित कोई प्रतिस्पर्धा हितों घोषणा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEFs | GlobalStem | GSC-6001G | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | |
| Purmorphamine | Cayman Chemical | 10009634 | |
| FGF-2 | EMD Millipore | GF003 | |
| BacMam NaV 1.2 | Invitrogen | B10341 |
References
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