Summary
Мы описываем небольшую молекулу-протокол для дифференциации мышиных эмбриональных стволовых клеток в клетки-предшественники олигодендроцитов (OPC). Этот протокол генерирует Olig2 + + NG2 OPCs с высоким КПД на 30 дней дифференциации. Мы также опишем метод для создания "пики" OPCs, что позволяет вести огонь потенциалов действия.
Abstract
Олигодендроциты являются myelinating клетки центральной нервной системы. Для регенеративной клеточной терапии при демиелинизирующих заболеваний, существует значительный интерес в получении чистой популяции родословной только зафиксированных олигодендроцитов клеток-предшественников (OPC) для трансплантации. OPCs характеризуются деятельности Olig2 фактора транскрипции и поверхностных выражение NG2 протеогликанов. Использование GFP-Olig2 (G-Olig2) мышиных эмбриональных стволовых клеток (мЭСК) репортер линии, мы оптимизировали условия для дифференциации mESCs в GFP + Olig2 + + NG2 OPCs. В нашем протокола, мы сначала опишем поколения эмбриоидные тела (ЭТ) от mESCs. Во-вторых, мы описываем лечение мЭСК полученных ЭТ с малыми молекулами: (1) ретиноевой кислотой (RA) и (2) Еж Соник (SHH) агонист purmorphamine (PUR) при определенных условиях культура направить EB дифференциации на олигодендроглиальных линии. При таком подходе, OPCs может быть получен с высокой эффективностью (> 80%) в срок до 30 дней. Клетки, полученные из mESCs в этом протоколе фенотипически похож на OPCs основе первичной культуре ткани. МЭСК полученных OPCs не показывают пики имущество описано для субпопуляции мозга OPCs на месте. Для изучения этого электрофизиологических свойств, мы описываем поколения пики мЭСК полученных OPCs по эктопически выражения Na
Protocol
Подробные процедуры получения олигодендроцитов клеток-предшественников (OPC) с GFP-Olig2 мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs):
- Мышь ES клеточной линии GFP-Olig2 (G-Olig2), закупается у Американской коллекции типовых культур (АТСС). MESCs обычно пассируют каждые 3 дня на облученных мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) фидерного слоя. MEF клетки высевают на 0,1% желатин покрытием шесть и культуры тканей пластины по крайней мере за день до пассажей ЭСК. МЭСК культуральной среде среднего Дульбеко изменение Орла (DMEM) (GIBCO) с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco), 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 0,1 мМ β-меркаптоэтанол /, 1% заменимые аминокислоты ( NEAA), и 1000 ед / мл подавления лейкоза фактор.
- МЧС колонии трипсином (TrypLE, 5 мин, 37 ° С) в одиночных камерах и приостановлено в нокаут сыворотке замены (КСР) носителя, после чего клетки переносятся в Costar сверхнизким привязанности шесть-луночного планшета (Corning) в ячейке плотностью 50000 клеток / см 2. В этих условиях mESCs форме эмбриоидных тел (ЭТ). KSR среда состоит из-минимальной необходимой среде (-MEM) с добавлением 20% KSR, 1 мМ пирувата натрия, 1% NEAA и 0,1 мМ β-меркаптоэтанол /.
- С первого дня 4 до 7 дней, ретиноевая кислота (RA, 0,2 М) и purmorphamine (Pur, 1 M) включены, как показано на рис. 1А в KSR или N2 среды. N2 среда MEM-содержащих 1X N2 добавка, 1 мМ пирувата натрия, 1% NEAA и 0,1 мМ β-меркаптоэтанол /. Среда меняется каждый день.
- На 8-й день ЭТ разбивкой использованием TrypLE (5 минут, 37 ° С) и высевают на 0,01% polyornithine покрытием блюда в OPC-среды, которая состоит из N2 средних и фактор роста фибробластов-2 (FGF-2, 20 нг / мл). Среда меняется каждые два дня.
- Клетки трипсином (TrypLE, 3 мин, 37 ° С) и replated примерно раз в неделю, когда они становятся вырожденным. На 30-й день, более 80% клеток показать GFP/Olig2 выражения и NG2-положительных, характерные для OPCs.
- Для создания пики OPCs, BacMam Na + каналов комплект используется для введения Na V 1.2 субъединицы в эти мЭСК полученных OPCs. Реагент BacMam (1 мл, компонентный) смешивается с PBS до конечного объема 5 мл. Затем, смешанного реагента BacMam добавляется в мЭСК происхождения культуры OPCs в 60 мм культуры блюдо (на 50-70% слияния) до промывки PBS. Через 2 часа инкубации, смешанного реагента BacMam удаляется и заменяется OPC среде, дополненной 1X усилитель. Энхансера компонента В восстановленный в ДМСО (компонент С). Затем, после дополнительных 2-ч инкубации среду с усилителем удален и заменен с полной среде OPC. Клетки анализировали 24 часов спустя.
Представитель Результаты:
После дифференциации протокола показан на рис. 1А, G-Olig2 mESCs были первоначально приостановлены в среду KSR и в течение 4 дней для формирования эмбриоидные тела (ЭТ) (рис. 1б). Затем мы последовательно рассматриваются ЭТ с РА и Пур. ЭТ не показали GFP флуоресценции при 4-й день, и выразил сильное флуоресценции GFP на D8 (рис. 1В). На данный момент времени, ЭТ трипсинизировали и высевают в N2 среде с факторами роста FGF-2. После дальнейшего культуры в течение 22 дней (D30), процент ячейки GFP + достигла 80,3 ± 0,6% в соответствии с нашими результатами проточной цитометрии. Как показано на рис. 1С, GFP + клеток перекрываются NG2 окрашивания последовательно (96,4 ± 1,3% GFP-положительных клеток были NG2 положительным, и 94,8 ± 1,5% от NG2 позитивные клетки GFP положительный). Таким образом, эти клетки экспрессируют GFP/Olig2 и NG2, определяя их как OPCs.
МЭСК полученных OPCs (76 клетки) не огонь потенциалов действия при деполяризации (рис. 2). После трансдуцирующих с бакуловирус проведения Na V 1.2 субъединицы, эти мЭСК полученных OPCs (94,1%, 16 из 17 клеток) могут быть классифицированы как пики (рис. 2В).
Рисунок 1. Дифференциация GOlig-мЭСК в OPCs. () Схема показывает протокол эмбриоидных тела (EB) основе и малые молекулы управляемой дифференциации. На D8, ЭТ были разбиты и высевают. Клетки пассировали раз в неделю, когда они стали сливной. (B), D8, но не D4 ЭТ, показал, GFP выражения. (C) Иммуноокрашивание из NG2 (красный) согласуется с GFP (зеленый) выражение в D30. DAPI (синий) была использована для выявления ядер. Шкала бар: 20 мм.
Рисунок 2. Генерация пики OPCs от nonspiking мЭСК полученных OPCs вирусом-опосредованный Na V канал выражения. () Мембранного потенциала была проведена при -60 мВ и мЭСК полученных OPCs не удалось уволить потенциалов действия, даже если ячейка была деполяризованного до 0 мВ. (B) пример мЭСК полученных OPCстрельба потенциала действия (выделено красным), после вирусной трансдукции.
Discussion
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), выделенных из бластоцисты эмбрион, могут дифференцироваться во все ячейки линий организма 3, 4, обеспечивая в модели системы пробирке для изучения раннего развития млекопитающих, в том числе олигодендроцитов спецификации. mESCs были показаны дифференцироваться в клетки-предшественники олигодендроцитов (OPC) с лечением Еж Соник (SHH) 5. Более того, Тсс-индуцированной OPC дифференциации от mESCs сохраняет правильную времени наблюдается в эмбриональном развитии 6. Таким образом, природа в пробирке OPC дифференциации от mESCs считается соответствует тому, что был изучен из в естественных условиях развития. Здесь, используя малые молекулы РА и Тсс Пур агонист, мы успешно дифференцированных G-Olig2 mESCs в GFP + Olig2 + + NG2 OPCs с высокой эффективностью.
OPCs, характеризуется выражением протеогликанов NG2 7 и спираль-петля-спираль транскрипционный фактор Olig2 8, генерировать олигодендроцитов в развивающихся и зрелых ЦНС, где они составляют значительный процент (~ 5%) от общего объема клеток и Основной пролиферирующих клеток типа 9. В течение почти двух десятилетий исследователи продемонстрировали Na V каналов выражаются в субпопуляции OPCs и может быть активирована на 10 деполяризации, 11. Более того, последние поразительное наблюдение 9 было то, что на месте ЦНС крыс белого вещества, OPCs (~ 50%), порожденный потенциалов действия, когда деполяризованной в зависимости от выражения напряжения натриевых (Na V) каналы, и поэтому могут быть подразделены на пики и nonspiking субпопуляций. Однако функции этих пики свойства до сих пор в значительной степени неизвестно. Мы обнаружили, что, электрофизиологическим, мЭСК полученных OPCs дифференцированы с Тсс-зависимых протокола, не были таким же, как на месте OPCs мозга. После введения субъединицы Na V 1.2, эти молчаливые мЭСК полученных OPCs способны были пики.
Таким образом, пики / nonspiking мЭСК полученных OPCs и дифференциации протокол, описанный здесь, может способствовать (1) изучение функциональных различий между пики и nonspiking OPCs, (2) скрининга новых факторов, которые могут способствовать выражению натриевых каналов в мЭСК полученных OPCs, ( 3) разработки и оптимизации дифференциации протокол OPCs из человеческих ЭСК или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs).
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана грантами для WD из Национального института здоровья (RO1 NS059043 и RO1 ES015988), Национального общества рассеянного склероза, Roche Фонд Анемия исследований, Фельдштейн Медицинский фонд, и Shriners больницы для детей.
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Дэвида Удовольствие и Дженнифер Plane для предложений. Мы заявляем, не конкурирующие интересы, связанные с этой статьей.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEFs | GlobalStem | GSC-6001G | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | |
| Purmorphamine | Cayman Chemical | 10009634 | |
| FGF-2 | EMD Millipore | GF003 | |
| BacMam NaV 1.2 | Invitrogen | B10341 |
References
- Xian, H., Gottlieb, D. I. Dividing Olig2-expressing progenitor cells derived from ES cells. Glia. 47 (1), 88-101 (2004).
- Clair, A., Gottlieb, D. I. A subset of ES-cell-derived neural cells marked by gene targeting. Stem Cells. 21 (1), 41-49 (2003).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Shin, S., Xue, H., Mattson, M. P., Rao, M. S. Stage-dependent Olig2 expression in motor neurons and oligodendrocytes differentiated from embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 16, 131-141 (2007).
- Billon, N., Jolicoeur, C., Ying, Q. L., Smith, A., Raff, M. Normal timing of oligodendrocyte development from genetically engineered, lineage-selectable mouse ES cells. J Cell Sci. 115, 3657-3665 (2002).
- Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Co-localization of NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells in the developing rat brain. J Neurosci Res. 43, 299-314 (1996).
- Ligon, K. L. Development of NG2 neural progenitor cells requires Olig gene function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 7853-7858 (2006).
- Dawson, M. R., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24, 476-488 (2003).
- Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561, 109-122 (2004).
- Karadottir, R., Hamilton, N. B., Bakiri, Y., Attwell, D. Spiking and nonspiking classes of oligodendrocyte precursor glia in CNS white matter. Nat Neurosci. 11, 450-456 (2008).
