Summary
我们描述了一种小分子为基础的小鼠胚胎干细胞分化成少突胶质前体细胞（OPCs的）协议。本协议产生高效率的30天的分化OLIG2 + NG2 + OPCs的。我们还描述了一种方法来生成可以触发动作电位的“尖峰”OPCs的。
Abstract
少突胶质细胞是中枢神经系统的myelinating的细胞。在脱髓鞘疾病的再生细胞疗法，有极大的兴趣中获得的纯系承诺的少突胶质前体细胞移植（OPCS）人口。 OPCs的特点是活动的转录因子OLIG2和表面的一种蛋白多糖NG2表达。使用GFP - OLIG2（G - OLIG2）小鼠胚胎干细胞（MESC）记者行，我们优化到GFP + OLIG2 + NG2 + OPCs的mESCs分化的条件。在我们的协议中，我们首先从mESCs描述生成的胚体（EBS）。其次，我们描述了与小分子治疗MESC衍生胚：（1），维甲酸（RA）和（2）刺猬（SHH）受体激动剂purmorphamine定义的培养条件下（PUR）直接分化成少突胶质细胞谱系EB。通过这种方法，OPCs能在30天的时间内获得高效率（> 80％）。从本议定书mESCs中衍生的细胞表型相似的基层组织培养的OPCs的。 MESC衍生OPCs的不显示属性描述脑OPCs的一个亚群在原地扣球。要研究这个电财产，我们描述异位表达娜的扣球MESC衍生OPCs的一代
Protocol
产生少突胶质前体细胞，GFP - OLIG2小鼠胚胎干细胞（mESCs）（OPCS）的详细程序：
- 小鼠胚胎干细胞系GFP - OLIG2（G - OLIG2），购自美国类型菌种保藏中心（ATCC）。 mESCs是常规传代，每3天到辐照的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层。上的MEF细胞接种到0.1％明胶包被的6孔组织培养板中至少有一个前传代的胚胎干细胞的一天。该MESC文化中期贝科的修改鹰的培养基（DMEM）（GIBCO）与20％胎牛血清（GIBCO），2 mM的L -谷氨酰胺，1 mM的钠丙酮酸，0.1 mM的β-巯基乙醇/，1％的不重要的氨基酸氨基酸补充（ NEAA），和1000 U / ml的白血病抑制因子。
- 的mES殖民地（TrypLE，5分钟，37℃）是胰酶消化成单个细胞，并在淘汰赛血清替代（KSR）中型中暂停，然后细胞被转移到一个中光学超低附件6孔板（康宁）在细胞50,000个细胞/平方厘米的密度。在这种情况下，mESCs形成胚状体（EBS）。 KSR介质组成的最小必要的培养基（MEM），辅以KSR 20％，1毫米丙酮酸钠，1％NEAA，和0.1毫米β-巯基乙醇/。
- 从第4天至7天，维甲酸（RA，0.2 M）和purmorphamine（PUR，1米）如图所示。在KSR 1A或N2培养基。氮气介质- MEM中含1X氮气补充，1毫米丙酮酸钠，1％NEAA，和0.1毫米β-巯基乙醇/的。媒介是改变日常生活。
- 在第8天，EBS分列在OPC介质氮气介质和成纤维细胞组成的0.01％polyornithine涂层菜TrypLE（5分钟，37℃）和电镀生长因子2（FGF - 2，20毫微克/毫升）。中期是每两天。
- 这些细胞是胰酶消化（TrypLE，3分钟，37℃）和replated约每星期当他们成为融合。在第30天，超过80％的细胞显示GFP/Olig2表达NG2阳性，OPCs的特点。
- 要生成扣球OPCs的，BacMam娜+通道套件是用来引入这些MESC派生OPCs的NA V 1.2亚基。 BacMam试剂（1毫升，A组份）混合，用PBS到5毫升的最终体积。然后，混合BacMam试剂加入到MESC衍生OPCs的文化在一个60毫米的培养皿中（在50-70％汇合）之前，用PBS漂洗。混合BacMam试剂2小时潜伏期后，被删除，而代之以辅以1X增强剂的OPC中等。增强在DMSO（Component c）将重组组件B。下一步，额外2小时的潜伏期后，与增强剂媒介被删除，而代之以完整的OPC介质。细胞24小时后检测。
代表性的成果：
图分化协议。 1A，G OLIG2 mESCs最初暂停在KSR介质为4天，以形成胚状体（EBS）（图1B）。然后，我们按顺序治疗RA和聚氨酯的EBS。在EBS没有显示任何在4天的绿色荧光，并表示强烈的绿色荧光D8（图1B）。在这个时间点，在EBS胰酶消化和镀辅以生长因子FGF - 2的氮气介质。为22天（D30）进一步文化后，GFP +细胞的比例达到80.3 ± 0.6％，根据我们的流式细胞仪检测结果。如图所示。 1C，GFP +细胞始终与NG2染色（96.4 ± 1.3％GFP阳性细胞NG2阳性，94.8 ± 1.5％NG2阳性细胞GFP阳性）重叠。因此，这些细胞表达GFP/Olig2和NG2，把它们定义为OPCs的。
MESC派生OPCs的（76细胞）没有火灾时动作电位去极化（图2A）。携带钠V 1.2亚基的杆状病毒转导后，这些MESC衍生OPCs的（94.1％，16 17个细胞），可列为扣球（图2B ）。
图1。分化成OPCs的GOlig - MESC（a）计划协议的胚体（EB）和小分子驱动分化。在首长级薪级第8点，在EBS进行了分类和镀。细胞传代，每星期一次，当他们成为融合。 （二）D8，但不D4胚，表明GFP的表达。 （三）与GFP（绿色）的表达在D30，NG2（红色）的免疫染色。 DAPI染色（蓝色）被用来确定的原子核。比例尺：20毫米。
图2。扣球OPCs的一代nonspiking由MESC衍生OPCs的病毒介导的钠V通道的表达 （A）膜电位在-60 mV和MESC衍生OPCs的举行未能消防行动的潜力，甚至当细胞去极化至0毫伏。 （二）MESC -派生OPC的一个例子烧制后的病毒转导的动作电位（以红色突出显示）。
Discussion
胚胎干细胞（ESC），从胚泡的胚胎中分离，可以分化成所有的细胞谱系的有机体3，4，在体外模型系统，为研究早期哺乳动物的发展，包括少突胶质细胞规范。已被证明mESCs分化成少突胶质前体细胞（OPCS）治疗与刺猬（SHH） 5。此外，SHH - OPC mESCs分化诱导保留正确的时机在胚胎发育6观察。因此， 在体外 OPC mESCs分化的性质被认为是与已在体内发育据悉一致。在这里，使用的小分子RA和SHH激动剂陈建，我们成功地分化成GFP + OLIG2 + NG2 + OPCs的高效率的G - OLIG2 mESCs。
OPCs的，表达的蛋白多糖NG2 7和螺旋-环-螺旋转录因子OLIG2 8特点，在发展中国家和成熟的中枢神经系统产生少突胶质细胞，其中包括一个重要的细胞总数的百分比（〜5％），是9类主要细胞增殖。近二十年的研究人员已经证实NA V通道中的一个亚群的OPCs表示，可以后去极化10，11激活。此外，最近的一次引人注目的观察9 OPCs的（〜50％）， 在原位大鼠中枢神经系统白质，产生动作电位后去极化时电压门控钠（钠五 ）渠道，表达，从而可以细分成扣球nonspiking亚群。然而，这些扣球属性的功能在很大程度上仍是未知。我们发现，electrophysiologically，MESC衍生OPCs的分化与SHH依赖协议，并没有在原位脑OPCs的相同。介绍亚基娜V 1.2后，这些无声的MESC衍生OPCs的扣球能力。
因此，扣球/ nonspiking MESC衍生OPCs的，这里所描述的分化协议可能有助于：（1）研究之间的扣球和nonspiking OPCs的功能上的差异，（2）筛选新的因素，可促进钠离子通道表达在MESC衍生OPCs以来，（ 3）开发和优化从人类胚胎或诱导多能干细胞（iPS细胞）分化OPCs的协议。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持部分由美国国立卫生研究院（RO1 NS059043 RO1 ES015988），国家多发性硬化症协会，罗氏对贫血的研究，费尔德斯坦医学基金会基金会，儿童施赖纳斯医院授予的WD。
我们要感谢国宝博士建议的愉悦和珍妮弗平面。我们声明没有竞争利益有关对这篇文章。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEFs | GlobalStem | GSC-6001G | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | |
| Purmorphamine | Cayman Chemical | 10009634 | |
| FGF-2 | EMD Millipore | GF003 | |
| BacMam NaV 1.2 | Invitrogen | B10341 |
References
- Xian, H., Gottlieb, D. I. Dividing Olig2-expressing progenitor cells derived from ES cells. Glia. 47 (1), 88-101 (2004).
- Clair, A., Gottlieb, D. I. A subset of ES-cell-derived neural cells marked by gene targeting. Stem Cells. 21 (1), 41-49 (2003).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Shin, S., Xue, H., Mattson, M. P., Rao, M. S. Stage-dependent Olig2 expression in motor neurons and oligodendrocytes differentiated from embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 16, 131-141 (2007).
- Billon, N., Jolicoeur, C., Ying, Q. L., Smith, A., Raff, M. Normal timing of oligodendrocyte development from genetically engineered, lineage-selectable mouse ES cells. J Cell Sci. 115, 3657-3665 (2002).
- Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Co-localization of NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells in the developing rat brain. J Neurosci Res. 43, 299-314 (1996).
- Ligon, K. L. Development of NG2 neural progenitor cells requires Olig gene function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 7853-7858 (2006).
- Dawson, M. R., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24, 476-488 (2003).
- Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561, 109-122 (2004).
- Karadottir, R., Hamilton, N. B., Bakiri, Y., Attwell, D. Spiking and nonspiking classes of oligodendrocyte precursor glia in CNS white matter. Nat Neurosci. 11, 450-456 (2008).
