Summary
Se describe una molécula basada en pequeñas protocolo para la diferenciación de las células madre embrionarias de ratón en células precursoras de oligodendrocitos (OPC). Este protocolo genera Olig2 + NG2 + OPC con alta eficiencia de 30 días de diferenciación. También describe un método para generar "picos" OPC que puede disparar potenciales de acción.
Abstract
Los oligodendrocitos son las células myelinating del sistema nervioso central. Para la terapia celular regenerativa en enfermedades desmielinizantes, existe un interés significativo en la obtención de una población pura de linaje comprometido precursores de oligodendrocitos (OPC) para el trasplante. OPC se caracterizan por la actividad de la Olig2 factor de transcripción y expresión en la superficie de un proteoglicano NG2. Uso de la GFP-Olig2 (G-Olig2) de ratón con células madre embrionarias (MESC) línea de reportero, que optimiza las condiciones para la diferenciación de las buenas prácticas agrarias en mESCs + + Olig2 NG2 + OPC. En nuestro protocolo, lo primero que describe la generación de cuerpos embrioides (EBS) de mESCs. En segundo lugar, se describe el tratamiento de la MESC derivados de EBS con pequeñas moléculas: (1) el ácido retinoico (RA) y (2) un erizo sónico (Shh) purmorphamine agonista (Pur) bajo condiciones de cultivo definido para dirigir la diferenciación EB en el linaje oligodendroglial. Con este enfoque, los OPC se puede obtener con una alta eficiencia (> 80%) en un plazo de 30 días. Las células derivadas de mESCs en este protocolo son fenotípicamente similares a los OPC derivadas del cultivo de tejidos primarios. El OPC MESC derivados no muestran la propiedad de adición se describe de una subpoblación de OPC cerebro in situ. Para el estudio de esta propiedad electrofisiológicos, se describe la generación de picos MESC derivados de OPC por ectópica expresando Na
Protocol
Los procedimientos detallados de la generación de oligodendrocitos precursor (OPC) de la GFP-Olig2 células madre embrionarias de ratón (mESCs):
- Línea de células ES de ratón GFP-Olig2 (G-Olig2), se compra a la American Type Culture Collection (ATCC). El mESCs son rutinariamente pasajes cada 3 días sobre una capa de ratón irradiados alimentador de fibroblastos embrionarios (MEF). Las células MEF se colocan en el 0,1% de gelatina con cubierta de seis pocillos de cultivo de tejidos por lo menos un día antes de los pases de la CES. El medio de cultivo MESC es Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) (Gibco) suplementado con 20% de suero fetal bovino (GIBCO), 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sodio, 0,1 mM mercaptoetanol β-/, 1% aminoácidos no esenciales ( AANE), y 1.000 U / ml de factor inhibidor de la leucemia.
- colonias se MES trypsinized (TrypLE, 5 min, 37 ° C) en las células individuales y en suspensión en octavos de final de reemplazo de suero (KSR) medio, entonces las células se transfieren a un Costar muy bajo apego de seis pocillos (Corning) en una celda densidad de 50.000 células / cm 2. En estas condiciones, mESCs formar cuerpos embrioides (EBS). Medio KSR consta de medio esencial mínimo (MEM-), complementado con un 20% KSR, 1 mM piruvato de sodio, 1% AANE, y 0,1 mM β-mercaptoetanol /.
- Del día 4 al día 7, el ácido retinoico (RA, 0,2 M) y purmorphamine (Pur, 1 M) se incluyen, como se muestra en la figura. 1A en KSR o medio N2. El medio es N2-MEM con suplemento 1X N2, 1 mM piruvato sódico, 1% AANE, y 0,1 mM β-mercaptoetanol /. El medio se cambia todos los días.
- En el día 8, EBS se desglosan con TrypLE (5 minutos, 37 º C) y se colocaron en poliornitina recubierto 0,01% los platos en medio de OPC, que consiste en medio N2 y factor de crecimiento fibroblástico-2 (FGF-2, 20 ng / ml). El medio se cambia cada dos días.
- Las células se trypsinized (TrypLE, 3 min, 37 ° C) y replated aproximadamente cada semana, cuando se hacen confluentes. El día 30, más del 80% de las células muestran GFP/Olig2 expresión y NG2 positivo, característico de los OPC.
- Para generar los OPC remate, el Na + BacMam canal kit se utiliza para introducir Na v 1.2 subunidad en estos OPC MESC derivados. El reactivo BacMam (1 ml, el componente A) se mezcla con PBS hasta un volumen final de 5 ml. Luego, el reactivo BacMam mezclado se añade en MESC derivados de la cultura OPC en una placa de cultivo de 60 mm (en la confluencia% 50-70) antes de lavar con PBS. Después de 2 horas de incubación, el reactivo BacMam mixto es eliminado y reemplazado con medio suplementado con 1X OPC potenciador. El potenciador es el componente B reconstituido en DMSO (componente C). A continuación, después de más de 2 horas de incubación con el medio potenciador es eliminado y reemplazado con medio completo OPC. Las células se analizaron 24 horas más tarde.
Los resultados representativos:
Siguiendo el protocolo de diferenciación de la figura. 1A, G-Olig2 mESCs fueron inicialmente suspendidos en un medio de KSR y durante 4 días para formar cuerpos embrioides (EBs) (Fig. 1B). Luego, sucesivamente tratados de la EBS con AR y Pur. El EBS no mostró fluorescencia de GFP en el Día 4 y expresó una fuerte fluorescencia de GFP en D8 (Fig. 1B). En este punto del tiempo, el EBS se trypsinized y chapada en medio N2 complementado con factores de crecimiento FGF-2. Después de la cultura más de 22 días (D30), el porcentaje de células GFP + llegó a 80,3 ± 0,6%, según los resultados de citometría de flujo. Como se muestra en la figura. 1C, GFP + células se superponen con NG2 coloración consistente (96,4 ± 1,3% de las células GFP positivos fueron positivos NG2, y 94,8 ± 1,5% de NG2 células positivas fueron positivas GFP). Por lo tanto, estas células expresan GFP/Olig2 y NG2, definiéndolos como OPC.
El OPC MESC derivados (76 células) no disparó los potenciales de acción en la despolarización (Fig. 2A). Después de transducción con un baculovirus que lleva el Na v 1.2 subunidad, estas OPCs MESC derivados (94,1%, 16 de 17 células) pueden ser clasificados como picos (Fig. 2B).
Figura 1. La diferenciación de GOlig-MESC en OPC. (A) Esquema que muestra el protocolo del cuerpo embrioides (EB) y basado en moléculas pequeñas impulsada por la diferenciación. En D8, el EBS se desagregaron y plateado. Las células fueron pasadas una vez por semana cuando se convirtió en confluente. (B) D8, pero no D4 EBS, mostró la expresión de GFP. (C) La inmunotinción de NG2 (rojo) fue consistente con las buenas prácticas agrarias (verde) en la expresión D30. DAPI (azul) se utilizó para identificar los núcleos. Barra de escala: 20 mm.
Figura 2. Generación de OPC picos de nonspiking MESC derivados de OPC por el virus mediada por Na v canal de expresión. (A) El potencial de membrana se llevó a cabo a -60 mV y OPC MESC derivados de no despedir a los potenciales de acción, incluso cuando la célula se despolariza a 0 mV. (B) Un ejemplo de MESC derivados de OPCdisparar potenciales de acción (en rojo) después de la transducción viral.
Discussion
Las células madre embrionarias (CME), aisladas de un embrión blastocisto, pueden diferenciarse en todos los linajes de las células del organismo 3, 4, proporcionando un sistema en el modelo in vitro para el estudio de desarrollo de los mamíferos tempranos, incluyendo la especificación de oligodendrocitos. mESCs se ha demostrado que se diferencian en células precursoras de oligodendrocitos (OPC) con el tratamiento de sonic hedgehog (Shh) 5. Por otra parte, la diferenciación inducida por Shh OPC de mESCs mantiene la sincronización correcta observado en el desarrollo embrionario 6. Por lo tanto, la naturaleza de la diferenciación in vitro de OPC mESCs se considera que es consistente con lo que se ha aprendido en el desarrollo in vivo. En este caso, utilizando el pequeño RA moléculas y el Pur agonista Shh, hemos podido diferenciar el mESCs G-Olig2 en GFP + + Olig2 NG2 + OPC con alta eficiencia.
OPC, que se caracteriza por la expresión de los proteoglicanos NG2 7 y el factor de transcripción hélice-lazo-hélice Olig2 8, generar oligodendrocitos en el SNC en desarrollo y madurez, donde representan un porcentaje importante (~ 5%) del total de células y son las principal tipo de células proliferantes 9. Durante casi dos décadas los investigadores han demostrado los canales de Na V se expresan en una subpoblación de los OPC y se puede activar a la despolarización de 10, 11. Por otra parte, una reciente observación sorprendente fue que en nueve en el SNC de rata in situ la materia blanca, los OPC (~ 50%) generaron los potenciales de acción cuando se despolariza dependiendo de la expresión del voltaje de sodio (Na V) canales, y por lo tanto podría subdividirse en remate y nonspiking subpoblaciones. Sin embargo, las funciones de estas propiedades de picos aún no se conocen. Hemos encontrado que, electrofisiológica, la OPC MESC derivados diferenciados con el protocolo de Shh-dependiente, no eran las mismas que las OPC en el cerebro in situ. Después de la introducción de la subunidad Na V 1.2, estos silenciosos MESC derivados de los OPC eran capaces de clavar.
Por lo tanto, la adición / nonspiking MESC derivados de los OPC y protocolo de diferenciación descrito aquí puede facilitar (1) el estudio de las diferencias funcionales entre los picos y nonspiking OPC, (2) los factores de selección nueva que podría promover la expresión de los canales de sodio en el OPC MESC derivados, ( 3) el desarrollo y la optimización del protocolo de diferenciación de los OPC de la ESC humanos o células madre pluripotentes inducidas (CMPi).
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de WD de los Institutos Nacionales de Salud (SR1 NS059043 y ES015988 SR1), la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple, Fundación Roche para la Investigación de la Anemia, Feldstein Medical Foundation, y los Hospitales Shriners para niños.
Nos gustaría agradecer al Dr. David Placer y el plano de Jennifer sugerencias. Declaramos que no hay intereses contrapuestos en relación con este artículo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEFs | GlobalStem | GSC-6001G | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | |
| Purmorphamine | Cayman Chemical | 10009634 | |
| FGF-2 | EMD Millipore | GF003 | |
| BacMam NaV 1.2 | Invitrogen | B10341 |
References
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