Summary
Vi beskriver en liten molekyl-baserat protokoll för differentiering av mus-embryonala stamceller till oligodendrocyte föregångare celler (OPC). Detta protokoll genererar Olig2 + NG2 + OPCs med hög effektivitet med 30 dagar av differentiering. Vi beskriver också en metod att generera "tillsatta" OPCs som kan avfyra aktionspotentialer.
Abstract
Oligodendrocyter är myelinating celler i centrala nervsystemet. För regenerativ cellterapi i demyeliniserande sjukdomar, det finns stort intresse följer en ren population av släkt-engagerade oligodendrocyte föregångare celler (OPC) för transplantation. OPCs kännetecknas av verksamheten i transkriptionsfaktor Olig2 och yta uttryck för en proteoglycan NG2. Med hjälp av GFP-Olig2 (G-Olig2) musen embryonala stamceller (Mesc) reporter linje, optimerad vi förutsättningar för differentiering av mESCs i GFP + Olig2 + NG2 + OPCs. I vårt protokoll, beskriver vi först generationen av embryoid organ (EBS) från mESCs. För det andra beskriver vi behandling av Mesc-derived EBS med små molekyler: (1) retinoinsyra (RA) och (2) en Sonic Hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (PUR) under definierade kulturen förutsättningar att direkt EB differentiering i oligodendroglial härstamning. Genom detta tillvägagångssätt kan OPCs erhållas med hög verkningsgrad (> 80%) i en tidsperiod på 30 dagar. Celler från mESCs i detta protokoll är fenotypiskt liknar OPCs härrör från primär vävnadskultur. Den Mesc-derived OPCs visar inte tillsatta egenskapen beskrivits för en subpopulation av hjärnan OPCs på plats. Att studera detta elektrofysiologiska egenskapen beskriver vi generering av tillsatta Mesc-derived OPCs av ectopically uttrycka Na
Protocol
Detaljerade förfaranden för att generera oligodendrocyte föregångare celler (OPC) från GFP-Olig2 musen embryonala stamceller (mESCs):
- Mus ES cellinje GFP-Olig2 (G-Olig2), köps från American Type Culture Collection (ATCC). Den mESCs rutinmässigt passerats var 3 dagar på en bestrålad mus embryonala fibroblaster (MEF) matare lager. MEF celler klädd i 0,1% gelatin-belagd sex-och vävnadsodling plattan minst en dag innan passaging den ekonomiska och sociala råden. Den Mesc odlingsmedium är Dulbecco ändrade Eagles medium (DMEM) (GIBCO) kompletteras med 20% fetalt bovint serum (GIBCO), 2 mM L-glutamin, 1 mm natrium pyruvat, 0,1 mM β-merkaptoetanol /, 1% onödiga aminosyror ( NEAA) och 1000 E / ml leukemi hämmande faktor.
- MES kolonier trypsinized (TrypLE, 5 min, 37 ° C) i enskilda celler och blandas med knockout serum ersättare (KSR) medium, då cellerna överförs till en Costar ultra-låg infästning sex brunnar (Corning) i en cell täthet på 50.000 celler / cm 2. Under dessa förhållanden, mESCs formen embryoid organ (EBS). KSR medel består av-minimal viktiga medel (-MEM) kompletterad med 20% KSR, 1 mm natrium pyruvat, 1% NEAA och 0,1 mM β-merkaptoetanol /.
- Från dag 4 till dag 7, är retinoinsyra (RA, 0,2 M) och purmorphamine (PUR, 1 M) ingår som visas i bild. 1A i KSR eller N2 medium. Den N2 medium-MEM innehåller 1X N2 komplettera, 1 mm natrium pyruvat, 1% NEAA och 0,1 mM β-merkaptoetanol /. Mediet ändras varje dag.
- Dag 8, är EB uppdelad med TrypLE (5min, 37 ° C) och pläterade på 0,01% polyornithine-belagda rätter i OPC-medium som består av N2 medelstora och fibroblast tillväxtfaktor-2 (FGF-2, 20 ng / ml). Mediet byts varannan dag.
- Cellerna är trypsinized (TrypLE, 3 min, 37 ° C) och replated ungefär varje vecka när de blir sammanhängande. På dag 30, över 80% av cellerna visar GFP/Olig2 uttryck och är NG2-positiva som är karakteristisk för OPC.
- För att generera tillsatta OPCs, den BacMam Na +-kanal kit används till att införa Na v 1,2 subenheten in i dessa Mesc-derived OPCs. Den BacMam reagens (1 ml, komponent A) blandas med PBS till en slutlig volym av 5 ml. Då är den blandade BacMam reagenset läggas in Mesc-derived OPCs kultur i en 60 mm kultur skålen (med 50-70% sammanflödet) innan sköljning med PBS. Efter 2 h inkubation, är den blandade BacMam reagens bort och ersättas med OPC mediet kompletteras med 1X förstärkare. Den förstärkare är den komponent B beredas i DMSO (komponent C). Sedan efter ytterligare 2-tim inkubation mediet med förstärkare tas bort och ersättas med komplett OPC medium. Cellerna analyseras 24 timmar senare.
Representativa resultat:
Efter differentiering protokollet visas i bild. 1A, G-Olig2 mESCs var inledningsvis svävande i KSR medium och i 4 dagar för att bilda embryoid organ (EBS) (Fig. 1B). Sedan behandlade vi sekventiellt EBS med RA och PUR. EBS visade ingen GFP fluorescens vid dag 4 och uttryckte starka GFP fluorescens vid D8 (Fig. 1B). Vid denna tidpunkt var EBS trypsinized och klädd i N2 mediet kompletteras med tillväxtfaktorer FGF-2. Efter ytterligare kultur för 22 dagar (D30) nådde andelen GFP + celler 80,3 ± 0,6% enligt våra flödescytometri resultat. Som visas i figur. 1C, GFP + celler överlappar NG2 färgning konsekvent (96,4 ± 1,3% av GFP positiva celler var NG2 positiva, och 94,8 ± 1,5% av NG2 positiva celler var GFP positiva). Således är dessa celler uttrycker GFP/Olig2 och NG2, definiera dem som OPCs.
Den Mesc-derived OPCs (76 celler) inte eld aktionspotentialer vid depolarisation (Fig. 2A). Efter transducing med baculovirus bär Na v 1,2 subenheten kan dessa Mesc-derived OPCs (94,1%, 16 av 17 celler) klassificeras som tillsatta (Fig. 2B).
Figur 1. Differentiering av GOlig-Mesc i OPCs. (A) system som visar protokollet från embryoid kroppen (EB)-baserade och små molekyler driven differentiering. På D8 var EBS uppdelade och pläterade. Cellerna har passerats en gång i veckan när de blev konfluenta. (B) D8, men inte D4 EBS, visade GFP uttryck. (C) immunfärgning av NG2 (röd) var förenlig med GFP (grönt) uttryck i D30. DAPI (blå) användes för att identifiera atomkärnor. Skala bar: 20 mm.
Figur 2. Generering av tillsatta OPCs från nonspiking Mesc-derived OPCs av virus-medierad Na mot kanalen uttryck. (A) membranpotential hölls vid -60 mV och Mesc som härrör OPCs misslyckats med att branden aktionspotentialer, även när cellen var depolarized till 0 mV. (B) Ett exempel på Mesc-derived OPCbränning aktionspotential (markerade i rött) efter virus transduktion.
Discussion
Embryonala stamceller (ESC), isolerade från en blastocyst embryo, kan differentiera till alla cell linjer av organismen 3, 4, vilket ger en in vitro modellsystem för att studera tidiga däggdjurens utveckling, inklusive oligodendrocyte specifikation. mESCs har visat att differentieras till oligodendrocyte föregångare celler (OPC) med behandling av Sonic Hedgehog (Shh) 5. Dessutom behåller Shh-inducerade OPC differentiering från mESCs rätt timing observerats i embryonalutvecklingen 6. Därför är den typ av in vitro OPC differentiering från mESCs anses vara förenliga med vad som har lärt sig av in vivo utveckling. Här, med hjälp av små molekyler RA och Shh Pur agonist, differentierade vi framgångsrikt G-Olig2 mESCs i GFP + Olig2 + NG2 + OPCs med hög verkningsgrad.
OPC, som karakteriseras av uttryck för proteoglycan NG2 7 och helix-loop-helix transkriptionsfaktor Olig2 8, genererar oligodendrocyter i utvecklingsländerna och mogna CNS, där de utgör en betydande andel (~ 5%) av den totala celler och är huvudsakliga förökar celltyp 9. Under nästan två decennier har forskare visat Na V kanaler uttrycks i en subpopulation av OPCs och kan aktiveras vid depolarisering 10, 11. Dessutom var en nyligen slående iakttagelse 9 som i in situ råtta CNS vita substansen, OPC (~ 50%) som genereras aktionspotentialer när depolarized beroende på uttryck av spänningskänsliga natrium (Na V) kanaler, och därmed kan delas in spiking och nonspiking subpopulationer. Men funktionerna för dessa tillsatta egenskaper är fortfarande till stor del okända. Vi fann att elektrofysiologi, var Mesc-derived OPCs differentieras med Shh-beroende-protokollet, inte samma som på plats hjärnan OPCs. Efter att införa subenhet Na V 1,2, var dessa tysta Mesc-derived OPCs kan spetsa.
Således kan tillsatta / nonspiking Mesc som härrör OPCs och differentiering protokoll beskrivs här underlättar (1) att studera funktionella skillnader mellan tillsatta och nonspiking OPCs, (2) screening nya faktorer som kan främja uttryck natrium kanal i Mesc som härrör OPCs, ( 3) utveckla och optimera differentiering protokollet för OPCs från mänskliga ESC eller inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs).
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete delvis finansierats med bidrag till WD från National Institutes of Health (RO1 NS059043 och RO1 ES015988), National Multiple Sclerosis Society, Roche Stiftelsen för anemi Forskning, Feldstein Medical Foundation och Shriners sjukhus för barn.
Vi vill tacka Dr David Pleasure och Jennifer Plane för förslag. Vi förklarar inga konkurrerande intressen med anknytning till denna artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEFs | GlobalStem | GSC-6001G | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | |
| Purmorphamine | Cayman Chemical | 10009634 | |
| FGF-2 | EMD Millipore | GF003 | |
| BacMam NaV 1.2 | Invitrogen | B10341 |
References
- Xian, H., Gottlieb, D. I. Dividing Olig2-expressing progenitor cells derived from ES cells. Glia. 47 (1), 88-101 (2004).
- Clair, A., Gottlieb, D. I. A subset of ES-cell-derived neural cells marked by gene targeting. Stem Cells. 21 (1), 41-49 (2003).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Shin, S., Xue, H., Mattson, M. P., Rao, M. S. Stage-dependent Olig2 expression in motor neurons and oligodendrocytes differentiated from embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 16, 131-141 (2007).
- Billon, N., Jolicoeur, C., Ying, Q. L., Smith, A., Raff, M. Normal timing of oligodendrocyte development from genetically engineered, lineage-selectable mouse ES cells. J Cell Sci. 115, 3657-3665 (2002).
- Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Co-localization of NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells in the developing rat brain. J Neurosci Res. 43, 299-314 (1996).
- Ligon, K. L. Development of NG2 neural progenitor cells requires Olig gene function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 7853-7858 (2006).
- Dawson, M. R., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24, 476-488 (2003).
- Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561, 109-122 (2004).
- Karadottir, R., Hamilton, N. B., Bakiri, Y., Attwell, D. Spiking and nonspiking classes of oligodendrocyte precursor glia in CNS white matter. Nat Neurosci. 11, 450-456 (2008).
