Вывод Мышь трофобласта стволовых клеток из бластоцист

Summary

В этом видео, мы демонстрируем изоляции мыши бластоцисты и вывод трофобласта стволовых клеток из бластоцист. Мы также описаны условия содержания имущества стволовых клеток, а также индукцию дифференциации в культуре.

Abstract

Спецификация трофэктодермы является одним из самых ранних событий дифференциации развития млекопитающих. Трофобласта линии происходит от имплантации трофэктодермы посредником и генерирует плода часть плаценты. В результате развития этой линии имеет важное значение для выживания эмбриона. Вывод трофобласта стволовых (TS) клеток из бластоцист мыши была впервые описана Танака

Protocol

В этом протоколе описываются подготовка мыши бластоцисты и создание линии TS клетки. Генеральный манипуляции мышью до коллекцию бластоцисты, в том числе созданы для естественного спаривания и индукция супер овуляции, в основном следовать стандартным протоколом иллюстрируется Надь и соавт. 2003 (pp146-150).

Вывод и поддержание клеток TS

1. Установка разведения нечто среднее между мышами интересов.
2. Подготовка мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) в качестве фидерных клеток. За два дня до сбора бластоцист, MEFs (2 х 10 ⁶ клеток) высевают в 100 мм блюд. На следующий день, эти клетки обрабатывают 10 мл среды TS содержащие митомицин С (20 мг / мл) в течение 2 ч инкубации при температуре 37 ° C, 5% СО _2. Это с последующей промывкой клетки в два раза с PBS. Митомицин С обработанные клетки, затем высевают в 12-луночных планшетах (1 х 10 ⁵ клеток / лунку).
3. В день бластоцисты сбор (3,5 DPC, называют первого дня), MEF культуральной среде заменяется TS средний плюс 1x FGF4/Heparin (0,5 мл / лунку).
4. Подготовка к коллекции матки: усыпить мыши и найдите матки (рис. 1А).
5. Удаление матки, держа ее щипцами на шейке матки (расположены за мочевого пузыря) и нарезать на переходе матки и шейки матки (рис. 1В). Вытяните матки, обрезки пленки и жир от тканей и сократить матки ниже слияния с яйцевода (рис. 1в). Место матки (рис. 1D) в небольшом объеме (0,2 мл) средней TS в 60 мм пластины.
6. Флеш каждый рог матки с 1 мл TS среде с использованием 1-мл шприц с 26-иглы. Введите иглу в основание матки и флеш-медленно в новой 60 мм пластины с 1 средний TS мл. Матка должна быть завышенной и расширенные полностью во время промывки.
7. Сбор и передача бластоцист внимательно в чистый 12-луночного планшета содержащие TS среде с помощью рта контролируемых пипетки. Вымойте бластоцист три раза последовательной передачи через среду TS в 12-луночных планшетах. Разместите один бластоцисты на скважину (рис. 2а) в 12-луночного планшета содержащие митомицин С обработанных питатели MEF и культуры при 37 ° C, 5% СО _2.
8. Бластоцист будет вылупляются из зона pellucida и присоединить к скважин от 24 до 36 часов. Небольшой нарост будет легко наблюдается на 3-й день. Поток культур с 500 мкл свежей среды TS плюс 1x FGF4/Heparin.
9. В день 4 или 5, бластоцисты результат должен быть готов к дезагрегации в зависимости от его размера. Идеальный размер для разбивки ячейки TS показано на рис 3B. Вымойте культур раз с 0,5 мл PBS. Добавить 100 мл 0,25% трипсин / ЭДТА и инкубировать 5 минут при 37 ° C, 5% СО _2. Перерыв нарост на мелкие сгустки с помощью пипетки вверх и вниз энергично pipetteman P100. Стоп трипсинизации, добавив TS-70см-1.5F4H (30% TS среды, 70% MEF-CM плюс 1,5 FGF4/Heparin) в колодец. Изменение среды через 8 часов после разукрупнения и продолжать кормить клетки каждые 2 дня.
10. Между дней 6 и 10 (сильно варьирует) ИР колонии клетки могут быть соблюдены. Они плоские, эпителиальных листа, как морфология с четкой границы колонии (рис. 2С). Продолжать кормить культур каждые 2 дня
11. Когда TS клетки достигают 50% слияния (обычно между днями 15 и 20), мыть один раз с PBS и добавьте 100 мл 0,25% трипсин / ЭДТА. Внесите вверх и вниз во трипсинизации обеспечить около одной клеточной суспензии. Стоп трипсинизации, добавив TS-70см-1.5F4H и трансфер в новой 6-и или 60-мм пластин содержащие митомицин С обработанных MEF фидеров (2,5 х 10 ⁵ cells/6-well или 5 x10 ⁵ cells/60mm пластины).
12. Изменение среды через 8 часов после прохода и продолжать кормить культур каждые 2 дня.
13. После еще одного или двух проходов (3-5 дней между проходов) на MEF питатели, TS клетки можно культивировать без них. Потому что MEFs приложить к культуре пластины намного быстрее, чем TS клеток после трипсинизации, такая разница в приверженцем курса могут быть использованы для отдельных TS клетки из фидеров MEF. После прохождения культуре клеток, инкубировать их при температуре 37 ° C, 5% СО ₂ в течение 30 мин. Большинство MEFs будет приложить к пластине и населения TS остается во взвешенном состоянии. Передача супернатант в новую пластинку. Повторите эту процедуру несколько проходов для получения чистой популяции TS.
14. Поддерживать TS клеток в TS-70см-1.5F4H и передавать их каждые 4 дня (1:10 до 1:20 сплит) или когда культура достигает 70% слияния. Передача клеток с высокой плотностью (выше, чем раскол 1:5) или культивирование их, когда слишком сливающийся может привести к их дифференциации.
15. Идентичность клеток TS может быть подтверждено иммуноокрашивания ячейки маркера, CDX2 (рис. 3).

Замораживание клетки TS

1. Подготовка 2x замерзания среды (50% FBS, 30% средний TS и 20% ДМСО).
2. Сотрудничествоllect TS клеток трипсинизации, после центрифугирования при 450g в течение 6 мин. Ресуспендируют их в среде TS с равным объемом 2x средний замораживания.
3. Замораживание клетки медленно, используя изопропиловый спирт камере при температуре -70 ° С и трансфер в жидкий азот, после 24-48 часов.
4. 60 мм пластин (70% сливной), как правило, хранятся в 2 ампул.

Размораживание TS клетки

1. Быстрое таяние флакон в 37 ° C, собрать их в 10 мл среды TS центрифугированием (450, 6 мин), и ресуспендируют в 30% TS СМИ, 70см-1.5F4H.
2. Один флакон клеток высевали в 60 мм пластины.

TS дифференцировки клеток в ТГК

Дифференциация TS клетки в гигантские клетки трофобласта (ТГК) может быть вызван выводом MEF-CM, FGF4 и гепарина. ТГК фенотип (большой ядер) могут быть обнаружены через четыре дня после индукции (Tanaka и соавт., 1998 и Chiu и соавт. 2008). Иммуноокрашивание из P450scc обнаружить выражение этого маркера в ТГК дифференцированной культуры (рис. 4А). Проточной цитометрии анализа ПИ (пропидий йодида) окрашенных клеток также показывает наличие дифференцированных клеток, содержащих более высокие содержания ДНК (рисунок 4B). Эти результаты показывают, что TS клетки подвергаются эндоредупликация стать полиплоидных ТГК.

Представитель Результаты

Рисунок 1. Препарирование мышей матки. () Расположение матки показано стрелками. (Б) Вырезать на переходе матки и шейки матки, как показано на рисунке. (C) Вырезать матки чуть ниже яйцевода (OD) под яичников (OV). (D) Изображение матки.

Фотографии Рисунок 2. Представителем иллюстрации мыши бластоциста, бластоциста нарост и трофобласта колонии. (А) бластоцисты мыши, собранные на E3.5 показано. ICM, внутренней клеточной массы; MT, росписи трофэктодермы; PT, полярные трофэктодермы. (B) трофобласта нарост на фидеры MEF показано. TS, клетка трофобласта стебля. (C) клетка трофобласта стволовых колонии показывает явное преимущество на фидеры MEF. Стрелки указывают на границе ячейки.

Рисунок 3. Идентификация клеток иммунной TS на анализ. TS (AD) и ES (контроль, EH) клетки могут быть маркером идентификации. Клетки immunostained с антителами признать Oct4 (А, Е) или CDX2 (B, F), и контрастно по DAPI (C, G) представлены в объединенных изображений (D, Н). Шкала бар, 50 мкм.

Рисунок 4. Дифференциация TS клетки в пробирке. (А) Недифференцированная (Undiff) или дифференцированными (Diff) клеток в культуре были исследованы на выражение ТГК маркер, P450scc (зеленый), контрастно с DAPI (красный). (B) проточной цитометрии анализа дифференцированных клеток, окрашивали PI, меры ДНК содержания (M1, от двух до четырех экземплярах, M2, более четырех экземплярах). М2 население составляет полиплоидных клеток трофобласта.

Discussion

В этом видео, мы демонстрируем процесс сбора E3.5 бластоцист из матки и экспериментальные процедуры установления TS клеточных линий. Мы также описываем условие для поддержания stemness ТС клеток и вызвать их дифференцировку в дифференцированных клеток. Два важных шагов для получения чистой линии клеток TS являются сроки результатом дезагрегирования (шаг 9) и обработки первого прохождения (шаг 11). Сообщалось, что примитивные эндодермы клеток, полученных могут возникнуть в культуре после обширных бластоцисты перерасти в шаге 9 или разрастание колоний TS (> 50% слияния) в шаге 11 (Kunath и соавт., 2005). Хотя примитивной энтодермы клеток, полученных можно определить по их отличительной морфологии с округлой формы клеток и уменьшение межклеточного контакта по сравнению с TS клетки, трудно удалить их из культуры, потому что они хорошо растут в среде, TS и не , кажется, требуют MEF питатели или FGF4.

Дифференцированных ТГК могут возникнуть постоянно в культуре TS даже в присутствии MEF-CM и FGF4. Если чистая населения TS желательно, эти дифференцированные клетки могут быть разделены на основе дифференциальных приверженцем ставок. Как и в MEFs, ТГК приложить к культуре пластин быстрее, чем TS клетки, обеспечивающие процедуру можно приобрести чистой популяции TS, как описано в шаге 13. Кроме того, поскольку ТГК очень приверженцем и более устойчивы к трипсинизации, чистой популяции TS также может быть получено путем быстрого trypisinization (3 мин), после чего коллекция приостановлено клетки TS.

Materials

Reagents

TS medium: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercapt–thanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C: Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM): Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 106/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA: Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x): Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x): Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).